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1、第5期高分子学报No.52000年10月ACTAPOLYMERICASINICAOct.,20003固定化木瓜蛋白酶的制备和性质研究33贺枫卓仁禧刘立建徐勉懿(武汉大学化学系国家教育部生物医用高分子材料开放研究实验室武汉430072)摘要多孔硅球固定化木瓜蛋白酶具有热增活性.本文在前文研究的基础上,用载体交联法制备了甲壳胺固定化木瓜蛋白酶和纤维素固定化木瓜蛋白酶.考察了固定化pH值、戊二醛浓度和给酶量对固定化木瓜蛋白酶活力的影响.研究了固定化木瓜蛋白酶的性质,特别是热稳定性和耐热性,并与溶液酶和多孔硅球固定化木瓜蛋白酶进行了比较.所制得的甲壳胺
2、固定化木瓜蛋白酶和纤维素固定化木瓜蛋白酶的最适反应温度均达到了80℃;90℃温育1h后固定化酶的活力保持在95%以上;70℃温育处理5h和6h后固定化酶的活力也仍能保持在90%以上.固定化木瓜蛋白酶的热稳定性和耐热性得到了显著提高.关键词固定化酶,甲壳胺,纤维素,热稳定性甲壳质是一种大量存在于甲壳动物、昆虫和星甲壳素有限公司;纤维素为杭州新华造纸厂生细菌中的直链多糖,它不溶于稀酸、稀碱以及有机产的大张滤纸;25%(W/V)戊二醛水溶液,溶剂,具有坚韧、惰性、无毒等特性;经浓碱处理Merck产品,进口分装;木瓜蛋白酶,Fluka产品;后,其分子的
3、乙酰基部分逐渐水解脱除,成为部分酪蛋白和半胱氨酸为生化试剂,其它试剂均为分或全部脱去乙酰基甲壳质,也称为甲壳胺.甲壳胺析纯试剂.岛津UV2240紫外可见分光光度计.已被广泛用于医药、食品、印染、纺织、造纸、生物112实验方法工程等领域,它在生物化学领域应用的一个重要11211多孔硅球的活化及烷基化氨丙基多孔[1～3]方面就是作为固定化酶的载体.纤维素是世硅球按文献方法[10]制备.界上最丰富的有机化合物,广泛地存在于棉、麻、11212甲壳胺的纯化称取10g甲壳胺粗产品,树木、野生植物等中,具有多种不同的形态,均不溶于200mL的2%乙酸水溶液中
4、,滤去不溶物,溶于水和有机溶剂.纤维素结构中存在着大量的搅拌下向滤液中滴加10%的氢氧化钠溶液,将产羟基,可通过各种反应制成多种纤维素衍生物而生的沉淀过滤,滤出物在蒸馏水中浸泡24h,然后带有各种活泼基团.纤维素广泛用于酶的固定化用2mol/L的盐酸调节溶液的pH值至中性,过滤[4～6]领域,用载体共价结合法制备固定化酶时,后用蒸馏水充分洗涤,再把滤出物于丙酮溶液中固定化方法多种多样,可适用于不同用途的需要.浸泡48h,50℃下真空干燥至恒重.[11]酶在高温下的催化反应,不仅可大幅度地提11213胺化纤维素的制备滤纸纤维素用高酶催化反应速度,
5、而且还可大大降低细菌污染3mol/L氢氧化钠溶液浸泡24h,得到的纸浆用蒸[7]的可能性以及提高反应的产率.前文曾首次报馏水充分洗涤,得到较均匀的纤维素.将50g纤维道了多孔硅球固定化木瓜蛋白酶的热增活素悬浮于150mL的1mol/L氢氧化钠溶液中,加[8,9]性,为高温下的酶促反应提供了很大的可能.入30mL的环氧氯丙烷,于60℃温育反应30min,本文继续报道以甲壳胺和纤维素为载体、戊二醛过滤,水洗后,再加入10g对苯二胺水溶液,于为交联剂的固定化木瓜蛋白酶的制备及有关性45℃下反应30min,用蒸馏水充分洗涤,真空干燥质,特别是热稳定性和
6、耐热性的研究.至恒重.11214固定化酶的制备分别以氨丙基多孔硅1实验部分球、甲壳胺(脱乙酰度为80%)和胺化纤维素为载111试剂与仪器体,利用戊二醛载体交联法,制备固定化木瓜蛋白甲壳胺(脱乙酰度为80%),广东省遂溪县南酶.具体方法如下:在锥瓶中加入015g载体,一定31999208205收稿,2000202222修稿;33通讯联系人637©1994-2010ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreserved.http://www.cnki.net638高分子学报20
7、00年pH值的011mol/L磷酸缓冲溶液(内含拥挤造成的空间位阻增大.制备多孔硅球固定化01005mol/L半胱氨酸和01001mol/LEDTA),以木瓜蛋白酶时,最佳给酶量为810mg/g载体;制及一定量木瓜蛋白酶和25%戊二醛溶液,室温下备甲壳胺固定化木瓜蛋白酶的最适给酶量为搅拌12h,抽滤,所制备的固定化酶用011mol/L1610mg/g载体;而制备纤维素固定化木瓜蛋白酶磷酸缓冲溶液充分洗涤,室温下真空干燥至恒重.的最适给酶量为1010mg/g载体.[12]11215酶活力的测定(1)固定化酶活力的212固定化酶的性质测定方法为,在
8、试管中加入1mL的011mol/L磷21211固定化酶的最适反应pH值如图1所酸缓冲溶液(pH=710,内含01005mol/L半胱氨示,在不同pH值
