固定化超氧化物歧化酶的制备和性质的研究

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1、独创性声明本人郑重声明，本学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果的总结。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本人将承担本声明引起的一切法律后果。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华中科

2、技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在_____年解密后适用本授权书。本论文属于不保密□。（请在以上方框内打“√”）学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日华中科技大学硕士学位论文固定化超氧化物歧化酶的制备与性质研究研究生:李磊导师:马长清教授中文摘要固定化酶作为现代生物工程技术的重要组成部分之一，在医学、分析与分离技术以及化学合成等领域有着广泛的用途。超氧化物歧化酶（super

3、oxidedismutase.简称SOD）是美国科学家Mccord和Fridovich1969年从牛血红细胞中发现的一种含有金属离子的酶，也是至今为止发现的唯一的以自由基为底物的酶。该酶能专一的清除生物氧化过程中产生的超氧阴离子自由基（O2.ˉ），在维护生物机体内自由基产生与清除的动态平衡过程中起着极其重要的作用。本课题制备了固定化超氧化物歧化酶，测定了固定化酶的活力，并对其理化性质进行了系统的研究。一、固定化超氧化物歧化酶的制备及活力测定本课题通过对甲壳素的去乙酰化制备并纯化壳聚糖，将壳聚糖与一定浓度的

4、戊二醛混合交联，使其发生氨醛缩合生成活化的载体，将超氧化物歧化酶与活化的载体混合搅拌后抽滤并洗涤，放置于4℃冰箱保存待用。以改进的邻苯三酚自氧化法为测定酶活力的方法。固定化超氧化物歧化酶活性可达到333U.g-1,酶活回收率为86.32%二、酶活力测定的两种方法比较测定超氧化物歧化酶的活力，常采用经典的邻苯三酚自氧化法。邻苯三酚在碱性条件下发生自氧化反应，生成中间产物红桔酚，同时生成O2.ˉ。邻苯三酚的自氧化率随着超氧阴离子O2.ˉ浓度的增加而增大。SOD能催化O2.ˉ发生歧化反应，生成H2O2和O2.ˉ

5、，从而抑制邻苯三酚的自氧化。样品对邻苯三酚的抑制程度，可反映样品中SOD的含量。本课题采用以维生素C为终止剂的邻苯三酚自氧化法测定SOD的活性。经研究，1华中科技大学硕士学位论文维生素C的加入，使原本持续的反应得以终止，为同时测定多组实验项数据提供了条件。而且本法相比较经典的邻苯三酚自氧化法，不存在统计学差异。三、固定化超氧化物歧化酶的理化性质测定本课题对固定化超氧化物歧化酶的贮存稳定性、pH稳定性与温度稳定性进行了研究，每天测定一次酶活力，得到其活力变化曲线，经测算，半衰期为43.8天；分别在各种pH条

6、件下测定酶的活力，结果固定化酶在pH6时活性最强；在各温度下测定酶活力，结果表明固定化酶的最适反应温度为45℃。固定化酶使用一次后回收，测得活力为初始的70.12%，使用两次后回收，测得活力为51.72%四、固定化超氧化物歧化酶的动力学研究本课题在国内首次对固定化超氧化物歧化酶进行了动力学研究，测定了固定化超氧化物歧化酶与溶液酶的米氏常数。固定化酶和溶液酶的米氏常数（Km）分别为0.18mmol/L和0.16mmol/L。固定化酶的Km略低于溶液酶，说明固定化处理影响了酶对底物的亲和力，使酶的活力降低了。

7、【关键词】超氧化物歧化酶，壳聚糖，固定化酶，邻苯三酚自氧化，动力学2华中科技大学硕士学位论文StudyonthepropertyandimmobilizationofsuperoxidedismutaseCandidate:LiLeiSupervisor:MaChangqingABSTRACTImmobilizedenzymetechniqueisanimportantcomponentofmodernbioengineeringandbiotechnology.Theapplicationofimmob

8、ilizedenzymeshasbeenwidelyusedinthefieldsofindustry,medicine,analyticalandseparationtechniques,chemicalsynthesis,andsoon.Superoxidedismutase(SOD)wasatypeofenzymethathasmetalionandwasfoundbyAmericanscientistsMccordan