固定化超氧化物歧化酶的制备与性质研究

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1、华中科技大学硕士学位论文本课题用浓碱液处理甲壳素,制备纯化了壳聚糖,再以壳聚糖为载体,用戊二醛作交联剂,制备固定化超氧化物歧化酶,探讨了固定化超氧化物歧化酶的最佳条件和固定化酶的理化性质。1.1仪器与试剂仪器SDC-6数控超级低温恒温槽（宁波天恒仪器厂）；UV-754紫外可见分光光度计；TGL-16M台式高速冷冻离心机；SYZ-B石英亚沸高纯水蒸馏器（江苏省宜兴市勤华石英玻璃仪器厂）。试剂甲壳素（生化试剂BR），中国医药（集团）上海化学试剂公司；铜锌超氧化物歧化酶（美国Sigma公司）；小牛血清白蛋白（罗氏制药有限公司）；戊二醛25%水溶

2、液（中国医药集团（上海）化学试剂公司）；维生素C（天津市科源化学试剂有限公司）；邻苯三酚（天津市标准科技有限公司）；三羟甲基氨基甲烷（Tris）（天津市博迪化工有限公司）；其他试剂均为分析纯。磷酸盐缓冲液（pH7.0）的配制：精密称量0.68g磷酸二氢钾，溶于29.1ml的0.1mol/l的NaOH溶液中，定容至100ml容量瓶。Tris-HCl（pH8.23）缓冲液的配制：取10ml0.2mol/l的三羟甲基氨基甲烷与9ml0.2mol/l的HCL溶液混合，加入21ml蒸馏水即可。含EDTA的Tris-HCl缓冲液的配制：精密称量0.1

3、86gEDTA,加入到500ml制备好的Tris-HCl（pH8.23）缓冲液。超氧化物歧化酶储备液的配制：取1mg的超氧化物歧化酶溶于10mL0.05mol·-1-1L(pH=6.0)的磷酸缓冲液中，使成0.1mg·mL。邻苯三酚溶液（45mmol/l）的配制：精密称量0.567g邻苯三酚，加水定容至100ml容量瓶，避光保存。维生素C（5%）溶液的配制：精密称量0.5g维生素C，加水定容于100ml容量瓶。0.3%戊二醛溶液配制：微量加样器吸取0.3ml的25%戊二醛溶液，加水定容至25ml。牛血清白蛋白溶液配制：取10mg牛血清白蛋

4、白加水溶解定容于100ml容量瓶中。7华中科技大学硕士学位论文亚沸水：通过石英亚沸高纯水蒸馏器蒸馏而得到，具有杂质含量少，纯度高的优点，有利于酶保持活性。1.2实验原理1.2.1酶固定化方法本章采用碱液法制备了具有较高氨基含量的壳聚糖，并以之为载体，利用戊二醛载体交联法，分两步制备了壳聚糖固定化超氧化物歧化酶。固定化方法如下图所示：CHOHN=CH(CH2)3CHONH22CH2OHOGlutaraldehydeOOOHOOH*OOHOOHOAcetate.40℃OnnCH2OHNHCOCHCH2OHNHCOCH33N=CH(CH2)3C

5、H=NCH2OHNH2OOOHOOH4OnCH2OHNHCOCH31.2.2酶活力测定原理本实验采用改进的邻苯三酚自氧化法测定SOD的活性。邻苯三酚在碱性条件下发.ˉ生自氧化反应，在自氧化过程中，超氧阴离子（O2）不断消失又不断生成，当达到.ˉ.ˉ稳态时，其浓度保持恒定，邻苯三酚的自氧化率呈O2浓度相关性。SOD能催化O2发生歧化反应，生成H2O2和O2，从而抑制邻苯三酚的自氧化。样品对邻苯三酚的抑制[4]程度，可反映样品中SOD的含量。实验测定在325nm处有色醌类的吸光度变化，反映出邻苯三酚自氧化反应的抑制程度。.ˉO2在水溶液中是中

6、等强度的还原剂和弱氧化剂，它能迅速参与单电子还原反应，但也能被强氧化剂还原。当强还原剂维生素C作为终止剂加到反应体系时，便迅速.ˉ与O2反应，从而阻止自氧化反应的继续进行。从而为同时测定多样品争取了时间。在规定条件下，1ml反应液中，每分钟使溶液在325nm处吸光度减小一半（即使邻苯三酚自氧化抑制率达50%）的酶量定义为1个酶活力单位。8华中科技大学硕士学位论文(其中：V为反应液的总体积，v为溶液酶的加入量，m为固定化酶的加入量。)1.3固定化酶的制备1.3.1壳聚糖的制备与纯化称20g甲壳素粉末，用400mL的47%氢氧化钠溶液于60℃

7、浸泡10h，用80℃的二次蒸馏水洗涤至中性后，再用47%氢氧化钠溶液重复处理一次，进一步脱乙酰化，最后用80℃热水洗至中性，干燥后得到白色粉末状壳聚糖。称取10g壳聚糖粗产品，溶于200mL1%的乙酸水溶液中，滤去不溶物，搅拌下向滤液中滴加5%的氢氧化钠溶液，将产生的沉淀过滤，滤出物在蒸馏水中浸泡24h，-1然后用1mol·L的盐酸调节溶液的pH值至中性，过滤后用蒸馏水充分洗涤，再把滤出物于丙酮溶液中浸泡48h，过滤，零下20℃冷冻24h，50℃下干燥至恒重。1.3.2壳聚糖的活化精密称取2.0g壳聚糖粉，加入25ml0.3%的戊二醛溶液

8、，室温下搅拌3h后，于4℃下放置过夜；次日抽滤，并用50ml磷酸盐缓冲液洗涤，得到淡黄色活化的壳聚糖粉末。室温干燥至恒重。1.3.3固定化酶制备精密称取0.5g活化后的壳聚糖粉末，加入10ml