可溶性固定化木瓜蛋白酶的制备及其性质研究

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1、可溶性固定化木瓜蛋白酶的制备及其性质研究作者：刘桦　林玲　王玉明　何浪【摘要】　　目的　制备一种可溶性固定化木瓜蛋白酶并对其部分酶学性质进行研究。方法　将木瓜蛋白酶偶联在亲水性高分子聚合物羧甲基纤维素醋酸琥珀酸酯（AS-L）上制备得到水溶性固定化木瓜蛋白酶。在相同的条件下测定游离的木瓜蛋白酶和水溶性固定化木瓜蛋白酶的活力，得到两种状态的酶的最适作用pH值和最适作用温度，再于它们各自的最适条件下测定活力，得到各自的Km值；在相同的条件下测定两种状态的酶的热稳定性、酸碱稳定性、低温稳定性和回收稳定性。结果　游离木瓜蛋白酶和可溶性固定化木瓜蛋白酶的最适

2、作用pH值分别为6.0和5.0，最适作用温度分别为60℃和70℃，Km值分别为2.53、3.07mg·ml-1；可溶性固定化木瓜蛋白酶在60℃条件下，保温12h，仍有62%的活性；在4℃条件下，30d后活性保留达90%以上；在pH6.0时稳定性最好，在pH4.0～7.0范围内也比较稳定（相对活性＞80%）。结论　可溶性固定化木瓜蛋白酶能够在pH5.5以上的溶液中完全溶解，最适作用pH值范围变窄，最适作用温度和Km值升高；热稳定性和酸碱稳定性均明显增强。【关键词】可溶性固定化酶；木瓜蛋白酶；酶学性质Abstract：ObjectiveToprepa

3、reasolubleimmobilizedpapainanddetermineitsenzymaticproperties.MethodsThesolubleimmobilizedpapainolecularpolymercarboxylmethylcelluloseaceticsuccinate.Underthesamecondition,theactivitiesofimmobilizedandsolublepapainsinedtoconcludethEiroptimumpHandtemperature,thenundertheseresp

4、ectiveoptimumconditions,thEIractivitiesinedtoconcludetheirKmvalue.Atthesametime,thethermodynamicstability,theacid-basestability,theloperaturestabilityandtheoperationalstabilityunpHvaluesofsolubleandimmobilizedpapainumtemperaturevaluesg·ml-1.Under60℃,after12hourstherelativeact

5、ivityofimmobilizedpapainmobilizedpapaindidn'tdecrease,andbetmobilizedpapaincanfullysolubilizeabovethepH5.5.TheoptimumpHrangeofpapainumtemperatureandKmvalueodynamticstabilityandtheacid-basestabilitymobilizedenzyme;papain;enzymaticproperty　木瓜蛋白酶［EC3.4.22.2］是一种重要的生化试剂。木瓜蛋白酶具有稳定性

6、好、水解催化活性高等特点，使其在食品、医药、纺织等工业生产中有着广泛的用途。近年来关于固定化木瓜蛋白酶的报道较多，但是研究主要集中在制备不溶性的固定化酶［1,2,3］。传统方法制备得到的不溶性固定化酶具有稳定性好和回收方便等优点，但是在面对难溶性底物和高粘度底物溶液时，应用却大大受限，催化效率低下。为此，本文将木瓜蛋白酶通过共价键固定在亲水性高分子载体AS－L上，制备得到了可以溶解于反应体系的可溶性固定化木瓜蛋白酶，通过游离酶和固定化酶若干性质的比较，为可溶性固定化木瓜蛋白酶在医药生产中的应用建立了技术基础。1　材料与方法成1.1　材料木瓜蛋白酶

7、（Sigama公司），羧甲基纤维素醋酸琥珀酸酯（AS-L，日本信越株式会社），1－乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺（EDC，上海东风生物技术有限公司），牛血清白蛋白（成都科龙化工试剂厂），考马氏亮兰G250（上海东风生化试剂公司），壳聚糖（上海伯奥生物科技有限公司，脱乙酰度≥90％）。其余试剂均为分析纯。1.2　方法1.2.1　蛋白质含量测定　参考1.2.6.3　低温稳定性　将上述SIP酶液置于4℃的冰箱中储存，分别于0d、5d、15d、20d、25d、30d测定其活性，以0d的酶活性为100%，计算不同时间的相对酶活性。1.2.6.4　

8、操作稳定性　将SIP溶液按1.4进行10次沉淀、溶解的回收操作，测定每次SIP溶解后的溶液总酶活力。分别以固定化操作前总酶活力为100％