木瓜蛋白酶的固定化及其在啤酒澄清中应用的研究

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1、维普资讯http://www.cqvip.com·6·天然产物分离2003年第1卷第3期木瓜蛋白酶的固定化及其在啤酒澄清中应用的研究徐元，何琦(中蓝晨光化工研究院四川省天然产物分离工程研究中心，四川成都610041)摘要：以高分子材料为载体对木瓜蛋白酶的固定化工艺进行了研究。筛选确定了最佳的酶固定化载体、固定化的工艺参数及所用载体的物理化学指标。结果表明，固定化酶的最适pH值为6．8，最适温度为75℃；在22℃下连续使用16天，酶活性基本不下降；在去离子水中4℃下贮存70天可保持酶活性不变。固定化酶用于防止啤酒蛋白质混浊效果极为明显，在不改变啤酒的感官指

2、标和理化指标的前提下，还能提高啤酒的氨基酸含量、提高营养成分。处理后的啤酒在4℃下贮存三个月无沉淀产生。关键词：木瓜蛋白酶；蛋白酶固定化；啤酒澄清木瓜蛋白酶已成功地应用于工业生产的许多领多次使用，以利降低固相酶成本；(3)固定化工艺域，如啤酒防浊、肉类嫩化、球蛋白水解与多肽合简单，不需要复杂设备。成等，因而引起人们的极大关注。但由于木瓜蛋白酶产量小、价格高，且应用起来有许多不尽人意之2技术路线处，如游离酶只能一次性使用，游离酶与产品不能本实验技术路线简示如下：分离等，使其的固定化越来越受到人们的重视。圈啤酒在贮存过程中，由于蛋白质、多酚、碳水化合物及氧和

3、金属催化剂的相互作用，导致蛋白质与多酚聚合，从而产生沉淀，影响啤酒的质量。生产厂家为了防止蛋白质沉淀，往往在啤酒中加入50×10左右的木瓜蛋白酶。尽管这种作法有其优点，圃一一圆但也有不足之处，如木瓜蛋白酶价格较贵，只能一次性使用，导致产品价格增加；且木瓜蛋白酶存在3实验部分于啤酒中会影响啤酒风味和泡沫的稳定性。因而在3．1原料及试剂啤酒生产中需采用固定化木瓜酶处理技术来提高啤木瓜蛋白酶清：6万IV／mL，生化，江门食用酒的质量，延长其贮存期，进而提高产品的竞争力。生化制品厂；酪氨酸：生化；半胱氨酸(LC)：生木瓜蛋白酶的固定化方法包括：(1)化学交联化；

4、酪蛋白：生化，进口分装；啤酒：绿叶牌，成结合法；(2)吸附法；(3)凝胶包埋法；(4)微胶都啤酒厂；三氯乙酸：AR，；乙二胺四乙酸钠囊法等。其中研究得最多、应用较广的是前两种。(EDTA)：AR。各种固定化方法的优缺点比较已有报道⋯1。本研究3．2仪器及设备采用的是吸附法。选择这种方法主要考虑了以下几恒温水浴振荡器：SHZ一82，江苏太仓医疗器械个方面的问题：(1)由于目标应用产品是啤酒，故厂；超级恒温水浴：CS501，重庆试验设备厂；pH在固定化过程中不能使用有毒的物质；(2)载体能计：PHS一2，上海第二分析仪器厂；UV分光光度维普资讯http://

5、www.cqvip.com2003年第1卷第3期天然产物分离·7·计：UV一120—2，日本Shimadzu公司；压汞仪：16天。每隔一定时间测定酶活。MicromeriticsAuto—Pore9200型；气相色谱：PE3．2．7酶吸附动力学的测定SIGMA2型；C．H．N．元素分析仪：1106型；原按25mL／gw的酶液／载体比将酶与载体加入具子吸收光谱仪：日立180—80型；红外光谱仪：塞三角瓶中。在给定温度下于恒温水浴振荡器中振PE580；氨基酸分析仪：日立835—50型。荡，每隔一定时间取上清液和原酶液测定O．D28o，3．2实验方法计算出吸附

6、率后对时间作图即可。3．2．1木瓜蛋白酶的固定化用去离子水将酶清配成2％的溶液，滤纸过滤；4结果与讨论按25mL的酶液／载体比将酶液加入装有载体的具4．1酶活及吸附率测定方法的讨论塞三角瓶中，于室温下振荡过夜，然后抽滤干上清4．1．1酪氨酸标准曲线的测定液即得到固相酶；固相酶用去离子水在抽滤条件下图1表明，在实验条件下，酪氨酸浓度与OD28o洗涤数次后，装瓶浸在去离子水中，置于电冰箱中呈线性关系。作回归，且取C=0．0时，OD28o=于4℃下贮存备用。0．0，则得：3．2．2啤酒的处理OD28o=4．87×10C(~g／mL)(4)将固相酶装柱(柱长值径

7、=6／1)，然后于4～式中，C为酪氨酸浓度。13℃将啤酒以一定流速(4～20BV／h)通过固酶根据(4)式与酶活的定义则可导出2、3式。柱，用啤酒瓶收集流出的啤酒，压盖密封，巴氏杀菌后置于4℃下贮存。3．2．3吸附率的测定待吸附结束后，以去离子水为空白，分别测定原配酶液与上清液的O．D28o值，然后按下式计算吸附率：吸附率=×100％(1)3．2．4酶活的测定图1酪氨酸标准曲线在具塞三角瓶中加入1．0mL2％的酶液(或4．1．2酶液浓度对酶活测定的影响0．20g湿固酶)，然后加入0．5mL(固酶加入1．0酶活的定义是：在一定温度下。每分钟内酶水mL)激活

8、剂[(0．006toolEDTA+0．03toolLC)／解蛋白释放出来的氨基酸