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1、壳聚糖固定化木瓜蛋白酶的研究的实验方案实验原理：以壳聚糖为载体，戊二醛为交联剂，采用两种方法制备了固定化木瓜蛋白酶。考察了固定化反应中pH值、戊二醛的浓度、温度以及给酶量对固定化胰蛋白酶活力的影响，并研究了这两种固定化木瓜蛋白酶的性质。海藻酸钠(SA)是一种天然的具有生物活性、生物降解性的聚阴离子多糖，壳聚糖(CS)是具有氨基的碱性多糖,具有良好的生物降解性、生物相容性,是一种无毒的聚阳离子电解质。阴阳聚电解质可通过静电吸附形成沉淀。天然多糖甲壳素的脱乙酰基产物-壳聚糖具有良好的生物相容性与生物亲和性。壳聚糖作为开发应用较晚的阳离子型多糖用作固定化酶的
2、载体，在结构上具有独特的优势。利用其分子侧链上大量的游离氨基，再选择适当的交联剂，可以使得酶共价结合于载体上的反应易于进行。此外壳聚糖还具有良好的机械性能、耐热性、抗菌性等优点性,木瓜蛋白酶因稳定性好、水解催化活性高等特点,在食品、医药、纺织等生产领域应用广泛。但由于其价格昂贵,溶液中易失活结块,难以分离回收等不足,限制了其在工业上的应用。酶的固定化有利于酶的分散、回收和稳定性,减少酶损耗和残余酶的再次污染,其有效性和经济性在很大程度上取决于酶的固定化。在本研究中，采用两种方法制备了壳聚糖固定化木瓜蛋白酶：一是用线型壳聚糖为载体，直接加入木瓜蛋白酶和交
3、联剂-戊二醛进行固定化反应；二是用网状壳聚糖为载体，即先用少量戊二醛将线型壳聚糖预交联成网状壳聚糖后，再加入木瓜蛋白酶和一定量的交联剂戊二醛进行固定化反应。实验过程：（一）SA/DDP/CS复合微球.的制备取液体石蜡,加司盘80，吐温20于三颈瓶中40℃水浴,高速乳匀10min,加入含有戊二醛的4%(w)海藻酸钠作为水相,搅拌30min.逐滴加入氯化钙溶液后继续乳匀3h,用石油醚和异丙醇充分洗涤,离心分离,40℃干燥即得载戊二醛海藻酸钠微球粉末.制备过程如下图所示.将上述制得的SA/DDP微球与一定浓度的壳聚糖溶液孵育30min后离心,收集微球,用同样
4、浓度的壳聚糖溶液清洗1次,再用水洗涤2次后40℃干燥,即得SA/DDP/CS复合微球.将上述经过再沉淀处理后的壳聚糖置于0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液中，加入一定量的木瓜蛋白酶搅拌均匀后，再滴加一定量的戊二醛水溶液，在磁力搅拌下反应6h。抽滤，先用蒸馏水洗涤，再用上述缓冲液洗涤，直至洗涤液中检测不到戊二醛和游离酶，真空干燥后即得颗粒状固定化酶。（二）酶活力的测定采用Folin原理测定木瓜蛋白酶和固定化木瓜蛋白酶的活力。具体方法如下：以2%的酪蛋白为底物，加入一定量的木瓜蛋白酶稀溶液或固定化木瓜蛋白酶，在40℃恒温振荡10min，终止反应后取
5、滤液用Folin试剂显色，测定其在波长650nm处的吸光度。（三）固定化木瓜蛋白酶最佳条件的确定1．固定化反应中pH值对固定化酶活力的影响固定戊二醛用量和给酶量，采用pH=5.0--10.0范围的缓冲液，制备固定化木瓜蛋白酶并测定固定化酶的活力。2．固定化反应中戊二醛浓度对固定化酶活力的影响以戊二醛为交联剂制备固定化酶时，由于戊二醛既是反应的交联剂，又是酶的变性剂，戊二醛的用量对固定化酶的活力具有显著的影响。在适宜pH的Tris-HCl缓冲液中，固定给酶量，加入一定量的戊二醛，使其终浓度变化范围为0.1~1.0%，制备固定化木瓜蛋白酶，然后测定固定化酶
6、的活力。3．固定化反应中给酶量对固定化酶活力的影响载体上偶联的酶量直接影响着固定化酶的活力。在最适pH、最适戊二醛浓度，固定载体用量，改变酶的投料量，制备固定化木瓜蛋白酶，然后测定固定化酶的活力。（四）固定化木瓜蛋白酶的酶学性质的研究1.固定化木瓜蛋白酶的最适反应pH值取一定量的固定化酶或稀释后的原酶，采用pH=5.0~10.0广范围的缓冲液，分别测定其对底物酪蛋白的水解活力2.固定化木瓜蛋白酶的最适反应温度取一定量的固定化酶或稀释后的原酶，在0.05mol/L的Tris-HCL缓冲液中，温度30~90℃范围内，测定其对酪蛋白的水解活力，3.固定化木瓜
7、蛋白酶和原酶的米氏常数Km各取多份相等质量的固定化木瓜蛋白酶或稀释后的原酶，在最适反应条件下，与一定量不同浓度的酪蛋白溶液反应10min，然后测定酶的活力，再用双倒数作图法求出米氏常数。4.固定化木瓜蛋白酶的稳定性（1）在0.05mol/L适宜PH的Tris-HCL缓冲液中，以2%的酪蛋白为底物，加入一定量的固定化酶或稀释后的原酶于固定化木瓜蛋白酶的最适反应温度水浴中保温，不同时间后测定酶的活力（2）。固定化木瓜蛋白酶和原酶在pH=5.0~10.0的缓冲液中，恒温25℃放置72h后测定相对酶活力。（3）有机溶剂是酶的变性剂。固定化胰蛋白酶和原酶在40℃
8、用不同浓度的乙醇水溶液（不加底物）处理30min后测定酶活力的变化。实验试剂及器材（一）试剂：
