基因操作的主要技术原

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1、第一章基因操作的主要技术原理第二节凝胶电泳凝胶电泳是一种分析鉴定重组DNA分子、蛋白质、蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段，同时也是分子生物学研究方法的技术基础。1凝胶电泳凝胶包含复杂的孔道网络，DNA分子必须通过这些孔道才能够到达阳极。小的DNA分子，在凝胶中迁移的更快。按凝胶材料分:聚丙烯酰胺凝胶琼脂糖凝胶电泳(普通和低熔点琼脂糖)按电泳装置分:水平式/琼脂糖凝胶竖式/聚丙烯酰胺凝胶两种方法比较：分离效果和分离范围;操作难易凝胶电泳的种类基本原理带有负电荷的DNA或RNA核苷酸链，依靠稳定的无反应活性的介质（琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶）和

2、缓冲液，在电场中以一定的迁移率从负极移向正极。根据核酸分子大小不同、构型或形状的差异，以及所带电荷的不同，可以通过电泳将其混合物中的不同成分彼此分开。2核酸电泳凝胶的成分和浓度决定能够分离的DNA大小琼脂糖凝胶：相对大的孔道，分离大一些的分子；聚丙烯酰胺凝胶：很小的孔道，分离小的DNA分子，能够分离仅仅相差一个核苷酸的DNA分子。用途琼脂糖凝胶：用于DNA和RNA的常规分析聚丙烯酰胺凝胶：常用于小分子核酸和蛋白质分析凝胶电泳的一般程序制胶，点样，电泳，染色，观察取决于核酸分子本身的大小和构型分子量较小的DNA分子，比分子量较大的DNA分子迁移

3、率要快；同等分子量的不同构型的核酸分子，构型紧密的比松散型的开环DNA分子或线性DNA分子迁移率要快。电泳的迁移率与凝胶的类型和密度相关琼脂糖凝胶的分辨力在0.2～50Kb之间;聚丙烯酰胺的分辨力在1～1000bp之间；凝胶电泳的分辨力SeparationRangeofAgarosePolyAcrylamideGels(PAGE)琼脂糖：一种从红色海藻中提取出的线性多糖聚合物。分为常熔点的琼脂糖低熔点（LMP）琼脂糖2琼脂糖凝胶电泳AgarosegelelectrophoresisLMP琼脂糖熔点：62～65℃熔解后，在37℃可保持液态数小时

4、；在25℃可保持液态约10min回收DNA分子在65℃下将LMP琼脂糖凝胶熔化；加入过量的酚抽提DNA；离心获得含DNA分子的上清液；琼脂糖凝胶电泳的参数：缓冲液：1×TAE（TBE,TPE）凝胶的含量：根据检测的DNA大小加DNA样品：<1μg，指示剂电泳条件：大片断低电压长时间，小片段高电压短时间使凝胶中的DNA分子可视化染色是最简单的方法。溴乙锭(EtBr)能够用来对琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中的DNA进行染色。只要在足够的DNA存在条件下，经过EtBr染色后，在紫外照射下能以不同的条带显示出来。注意：溴乙锭是非常强的致癌物；紫外光也会灼伤

5、。因此，用于把DNA染成蓝色或绿色，又不需要紫外照射就能看见DNA的非致癌染料，越来越多地被用于实验室研究中。染色和观察：溴化乙锭（EB）染色，在300nm波长的紫外下观察（凝胶成像仪）能看到0.05μg的微量DNADNA的片断大小与荧光强度成正比DNA分子大小的估计如何确定凝胶电泳中片段的大小?最准确的方法：利用迁移速度和分子重量间的数学关系。相关公式是：D=a-b(logM)D是迁移的距离，M是相对分子质量，a和b是依赖于电泳条件的常数。通常使用：一种简单，但相对不太精确的估计DNA片段大小的方法。方法：利用已知大小的DNA片段作标准(m

6、arker/ladder),目的DNA片段与之比对、估计。例如：HindⅢ将λDNA切成8个片段，这些片段的大小都已经知道，范围从125bp到23kb。实验中的片段大小可以通过对比两条泳道中条带的位置而加以估计。尽管不十分精确，这种方法进行起来只有5％的错误率SampleWell25ng1kbladder0.8%Agarose124681012kbAgaroseGelElectrophoresisEtBrDetectionLimit:~5-10ngDNA根据标准DNA相对迁移距离推测待测定的DNA片段的大小Agarosegelelectrop

7、horesis对放射性标记的DNA进行放射性自显影染色的一个缺陷是其灵敏性的限制，如果每条带中DNA的含量少于10ng，则很有可能在染色后仍然看不到条带。对于微量的DNA就需要更加灵敏的检测手段。放射自显影是一个很好的方法。电泳前将DNA结合上放射性标记，利用X射线敏感摄影对凝胶进行拍摄就能够肉眼观察到DNA分子。放射性DNA使胶片曝光，显示出DNA条带。聚丙烯酰胺凝胶：丙稀酰胺/亚甲双丙稀酰胺（29：1）TEMED过硫酸铵（10％）缓冲液：TBE3聚丙烯酰胺凝胶电泳链分离凝胶-SSCP用于单链分离,可以进行SNP的检测。PAGE原理：SNP

8、:DNA长度相同，仅一个碱基不同；加热后解链后电泳，迁移速度不同。可以分离1bp的差异用途：测序、AFLP、为避免局部区域产生二级结构，可采用各种变性措施，如煮沸样