基因工程涉及的主要技术

《基因工程涉及的主要技术》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、基因工程涉及的主要技术遗传专业姓名：张红学号1310170039导师：张斌基因工程基因工程（Geneticengineering）原称遗传工程。从狭义上讲，基因工程是指将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。基因工程的操作流程DNA和RNA的提取和纯化PCR扩增构建基因文库，从基因文库中“钓”取1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定限制酶的切割与连接农杆菌转化法等分子杂交及DNA测序基因工程主要技术DNA和RNA的提取和纯化凝胶电泳基因扩增技术-PCR反

2、应分子杂交DNA序列测序12345一、DNA和RNA的提取和纯化核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作。一般程序1、供体的核酸分离供体细胞培养收集(菌体)细胞细胞破碎分离总DNA分离细胞器分离总RNA分离细胞器DNARNApoly(A)RNA特异性RNA染色体DNA(组建基因组文库)cDNA（组建cDNA文库）DNA提取的几种方法（1）基因组DNA的提取CTAB法SDS法其它（2）非基因组DNA的提取质粒DNA的提取碱裂解法煮沸法线粒体、叶绿体DNA的提取差速离心结合SDS裂解法基因组DNA-CTAB法

3、原理（植物DNA提取经典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/LNaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。注：CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。CTAB法流程图植物材料裂解液上层溶液液氮研磨抽提细胞裂解干燥溶解离心洗涤酒精沉淀DNA溶液质粒DNA－碱裂解法碱裂解法由Birnboim和Doly设计并于19

4、79年发表，基于染色体DNA与质粒DNA变性与复性的差异而达到分离目的。在pH高达12.5的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。当以pH4.6的KAc高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。对数期菌体溶液III中和溶液I充分重悬溶液II裂解上清液抽提离心洗涤酒精沉淀干燥溶解沉淀质粒DNA溶液碱裂解法流程图蛋白质的去除：酚/氯仿抽

5、提使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等）高盐洗涤蛋白酶处理多糖的去除：高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5MNaCl，高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500μLDNA液中加入200μl20%PEG8000(含1.2MNaCl)，冰浴20min。多酚的去除：在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：β-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合盐离子的去除

6、：70％的乙醇洗涤总RNA的提取根据所用蛋白质变性剂种类不一样分为以下三种制备方法：1）热苯酚抽提法2）胍盐法：异硫氰酸胍和硫氰酸胍3）LiCl/尿素法其中以胍盐法最好，对于从那些RNase含量很高的组织（胰脏）中提取RNA特别有效，可使RNase迅速变性，制备的RNA有较高翻译活性。在RNA制备中，细胞破碎与蛋白质变性是同步进行的。二、凝胶电泳常见的凝胶电泳电泳主要类型分离根据适用范围琼脂糖凝胶电泳电荷量、相对分子质量和构型核酸聚丙烯酰胺凝胶电泳相对分子质量、电荷核酸和蛋白质脉冲电场凝胶电泳在交流电场中做出反应的时间分离长至5Mb的DNA分子等电点聚焦电泳等电点蛋白质琼脂糖凝胶电泳凝胶电泳的

7、原理：分离原理-在电场的作用下，DNA分子在琼脂糖凝胶中移动时，有电荷效应和分子筛效应。检测原理-溴化乙锭（EB）在紫外光照射下能发射荧光，当用EB对DNA样品染色时，加入的EB就插入DNA分子中，荧光强度与DNA含量成正比。琼脂糖凝胶电泳分辨大小在0.1-60kb间的DNA片段；而要分辨较小分子质量的DNA片段，要用聚丙烯酰胺凝胶，它的分辨率在0.001-1kb之间。聚丙酰胺凝胶电泳三、基因扩增