基因工程的主要技术原理

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1、第二章基因工程的主要技术原理一、质粒DNA的提取闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快；（1）原理1.碱裂解法提取质粒DNADNA双链变性DNA单链复性强碱中性染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质—SDS复合物结合在一起;当K+取代Na+时,生成不溶的PDS,这些复合物从溶液中沉淀下来。变性利用宿主菌线状染色体DNA与闭环双链质粒DNA的结构状态的差异来提取质粒DNA。当同时碱变性时，线状基因组DNA变性充分而质粒DNA处于拓扑缠绕的自然状态而不能彼此分开。当条件恢复时（酸中和），质粒DNA迅速准确配置重新形成完全

2、天然超螺旋分子，而线状DNA则与破裂的细胞壁，细菌蛋白相互缠绕成大型复合物，被SDS包盖。当K+取代Na+时,这些复合物会从溶液中沉淀下来，附在细胞碎片上一起被离心除去。碱裂解法（2）所用的试剂作用①葡萄糖增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力（震荡）的作用而降解。②EDTAMg2+、Ca2+的螯合剂，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。③NaOH-SDSNaOH：强碱，提供pH>12的碱性条件，使DNA双链变性。SDS:溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成“蛋白—SDS”复合物，使蛋白质（包括DNA酶）变性沉淀。冰醋酸把醋酸钾溶液的pH调到4.8。用来中和N

3、aOH变性液，使DNA复性。高浓度的K+置换Na+,生成不溶的PDS用于沉淀DNA。⑤乙醇DNA分子以水合状态“溶于”水里，乙醇能夺去DNA分子的水环境。④KAc-HAc缓冲液⑥RNaseA降解RNA渣滓。以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。⑦TE缓冲液DNA保存液。由Tris-HCl和EDTA配制。Tris-HCl维持溶液中pH值相对稳定；EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解。蛋白变性剂，进一步抽提DNA溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。但苯酚会残留在DNA溶液中。（现多用各种商品化的层析柱纯化DNA)。⑧酚-氯仿选用以上试剂有商业试剂盒；也可以自己配制。（3）碱抽提

4、法提取质粒DNA的步骤SolutionI的配制：使用“溶液Ⅰ”悬浮菌体。第一步：悬浮菌体25mMTris-HCl(pH8.0)，10mMEDTA，溶液II破坏细胞膜，蛋白质和DNA变性。第二步：破膜，蛋白质和DNA变性SolutionII的配制：第三步：中和溶液III使DNA复性、并促使蛋白质-SDS复合物和染色体DNA沉淀。SolutionIII的配制：0.2NNaOH，1.0%SDS5M乙酸钾（用冰醋酸调pH至4.8）上清液中含有闭合质粒DNA。第四步：离心除去沉淀0.6倍体积的异丙醇或2倍体积的乙醇。第五步：纯化DNA上清液过柱或酚-氯仿抽提。第六步：沉淀DNA与待扩

5、增的模板DNA区段的两3’端序列互补（5‘端相同）的短DNA。①位置3’3’引物设计现在多用专业软件如Primer5.0等二、引物（primer)设计②引物的长度一般引物设计为长18—30bp。③引物的特异性引物应与核苷酸序列数据库的其他序列无明显同源性。④引物的碱基序列5’端根据需要可设计成某个内切酶的切点顺序、RNA聚合酶识别序列、突变位点或生物素标记等，方便与以后操作。5’ATGCAGAAACTGATCGATCGATCGAT3’3’GCTAGCTACTTAAG5’3‘端（特别是最末及倒数三个碱基）必须与模板严格配对，5’端可以不配对。templateprimer尽可能

6、提高G+C含量，以提高引物与模板的结合力,G+C含量以45%-65%为宜。⑤引物的碱基组成避免连续4个以上相同碱基排列或内部回文序列.5’GGCAGTCTGCCAGTCTAC3’CTGCCAGTCTAC3’GACGG5’T发卡结构1）2）3）避免形成引物二聚体（dimer）两个引物之间不能有两个以上的连续碱基序列互补。5’GGTCTGCCAGTCTAC3’3’CAGGACTTAGTCACT5’primer1primer2⑥引物的Tm值Tm=（G+C)4+(A+T)2适当提高复性温度可以提高引物与模板结合的特异性，减少非特异产物的出现。实际复性温度选择低于Tm值5-10o

7、C。经验公式计算：Tm值是指溶液中有半数的DNA分子解链为单链时的温度。两条引物的Tm值尽可能相等或相近，最好相差不超过2oC。三、增加PCR特异性的措施（1）引物设计（2）引物的退火温度（3）循环次数（4）TaqDNA聚合酶，利用高保真DNA聚合酶（5）降落PCR（6）热启动PCR（7）巢式PCR四.PCR技术的扩展（1）巢式PCR(nestPCR)此时进行二步PCR，第二级PCR需另行设置反应体系，并应用另外的PCR引物，此时引物的位置位于初级PCR引物的内侧，用初级PCR产物做模板，进行第二步不饱和PCR扩增