第一章 基因工程的主要技术原理

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1、第一章基因工程的主要技术原理第一节DNA的提取与纯化由于提取DNA的目的、种类、所用的生物、组织材料、实验条件等不同，DNA的提纯有很多方法。其中最常用的是碱抽提法。一、质粒DNA的提取1.碱抽提法提取质粒DNA（1）原理闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快；染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质—SDS复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。（2）所用的试剂作用①溶菌酶能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的b-1，4糖苷键。在碱性条件（pH>8）下有活性。②葡萄糖增加溶液

2、的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力（震荡）的作用而降解。③EDTAMg2+、Ca2+的螯合剂，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。④NaOH-SDSNaOH：强碱，提供pH>12的碱性条件，使DNA双链变性。SDS:溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成“蛋白—SDS”复合物，使蛋白质（包括DNA酶）变性沉淀。⑤NaAc-HAc缓冲液冰醋酸把醋酸钠溶液的pH调到4.8。用来中和NaOH变性液，使DNA复性。高浓度的NaAc有利于变性的大分子（蛋白质、DNA、RNA等）沉淀。⑥乙醇用于沉淀DNA。DNA分子以水合状态“溶于”水里

3、，乙醇能夺去DNA分子的水环境。⑦RNaseA降解RNA渣滓。以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。⑧TE缓冲液DNA保存液。由Tris-HCl和EDTA配制。Tris-HCl不含金属离子（不同于磷酸缓冲液或硼酸缓冲液），有利于以后操作；EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解。⑨酚-氯仿选用蛋白变性剂，进一步抽提DNA溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。但苯酚会残留在DNA溶液中。（现多用各种商品化的层析柱纯化DNA)。（3）碱抽提法提取质粒DNA的步骤第一步：溶菌使用“溶液Ⅰ”溶解细菌细胞壁。SolutionI的配制：50mM葡萄糖，

4、25mMTris-HCl(pH8.0)，10mMEDTA，4-5mg/ml溶菌酶，RNaseA第二步：破膜，蛋白质和DNA变性溶液II破坏细胞膜，蛋白质和DNA变性。SolutionII的配制：0.2NNaOH，1.0%SDS第三步：中和溶液III使DNA复性、并促使蛋白质-SDS复合物和染色体DNA、RNA沉淀。SolutionIII的配制：3M醋酸钠（用冰醋酸调pH至4.8）二、基因组或其他DNA的提取1.细菌基因组DNA的制备一般过程及原理：（1）细胞裂解10%SDS和蛋白酶K。37oC温育。不用NaOH!（2）DNA纯化CTA

5、B(十六烷基三甲基溴化铵)除去多糖，酚-氯仿-异戊醇除去蛋白质。（3）沉淀DNA0.6倍体积的异丙醇。2.哺乳动物细胞基因组DNA的抽提一般过程及原理：（1）组织粉碎动物组织剪成小块，置液氮中冻结后研磨成细粉末。组织培养的细胞用胰酶消化松散后直接使用。（2）细胞裂解0.5%SDS和0.1mg/ml蛋白酶K。50oC温育。SDS是离子型去垢剂（detergent），可以使细胞膜崩解。（3）纯化DNA用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白质污染。（4）沉淀DNA用2倍体积的无水乙醇。（可以加入1/10体积的3M醋酸氨辅助沉淀）（5）除去RNA污染3

6、.从植物组织中制备DNA一般过程及原理：（1）组织粉碎用液氮冷冻后研磨成细粉末。（2）细胞裂解用2%CTAB/2-ME(十六烷基三甲基溴化铵/2巯基乙醇）。或1%SDS和蛋白酶K。用RNase。（3）纯化DNA用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白质污染。（4）沉淀DNA用0.6倍体积的异丙醇（-20oC）（可以加入1/10体积的3M醋酸氨辅助沉淀）（5）除去RNA污染用RNaseA三、DNA的定量和纯度测定1.紫外光谱法原理：ØDNA（或RNA）在260nm波长处有特异的紫外吸收峰，1OD的光密度相当于双链DNA浓度为50μg/mL。Ø蛋白质

7、在280nm处有吸收峰Ø取3ml去离子水，加入比色皿，再加10ul的质粒，用1ml的移液枪充分混匀。用比色杯在紫外分光光度计直接测定。1、根据OD值计算DNA浓度（μg/mL）[dSDNA]=50×（OD260-OD310）×稀释倍数其中260nm读数用来估算样品中核酸浓度，310nm为背景吸收值。2、根据OD值计算DNA纯度纯DNA样品的OD260/OD280大约为1.8，若OD260/OD280介于1.7－1.9之间，说明质粒质量较好，1.8为最佳；低于1.8说明有蛋白质污染，大于1.8说明有RNA污染。2.琼脂糖凝胶电泳估计原理

8、：溴化乙锭（EB）能插入DNA分子中，紫外光照射下能发红色荧光与已知浓度的DNA电泳带荧光强度对比，就可以估计出DNA含量四、DNA分子量的估计一般使用琼脂糖凝胶电泳，与已知分子量的DNA标准混合液对比得知DNA分子量M