基因工程第4章基因工程的主要技术ppt课件.ppt

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1、Review（一）λ噬菌体克隆载体1、λ噬菌体的一般生物学特性（P42）线形双链DNA分子长度约为48.5kbcos位点在λDNA分子两端各有12nt的单链5’互补粘性末端，且两者的核苷酸序列互补，当λ噬菌体进入细菌细胞后，其DNA可迅速通过粘性末端配对而成双链环状DNA分子，这种由粘性末端结合形成的双链区域称为cos位点（cohesiveendsite）2λ噬菌体基因组λDNA至少包括61个基因，除少数例外，大多数编码基因均是按功能的相似性成簇排列有些区段对λ噬菌体的生长不是绝对必需的。J基因→N基因：约占λDNA总长度三分之一，对于λ噬菌体的裂解周期而言是非必需的，这

2、一区段的缺失或在此段插入外源DNA片段，将不影响入噬菌体的增殖。这就是λ噬菌体可作为基因工程载体的一个重要的依据。P基因→Q基因野生型λ噬菌体DNA及相应的λ噬菌体DNA图谱左臂：从A到J长约20kb，其中的基因编码构成头部、尾部、尾丝对组装完整噬菌体所需要的蛋白质。中段：长约20kb，是λDNA整合和切出，溶原生长所需的序列，但非溶菌生长所必需右臂：长约10kb，控制溶菌和溶原生长最重要的调控基因和序列、以及λDNA复制起始均在这区域内。λ噬菌体载体的类型插入型载体（insertionvectors）：只具有一个限制酶位点，可便于外源DNA插入的称为插入型载体。置换型载

3、体（replacementvector）：含有二个限制酶切点，在两个位点之间的DNA区段可以被外源DNA片段所取代。P44包装容量λ噬菌体头部外壳蛋白质容纳DNA的能力是有一定限度的。上限不得超过其正常野生型DNA总量的5％左右，而低限又不得少于正常野生型DNA总量的75％。按野生型λDNA分子长度为48kb计算，λ噬菌体的包装上限是51kb。编码必要基因的DNA区段占28kb，因此λ载体克隆外源DNA的理论极限值应是23kb。这比质粒载体能插入的DNA长得多；而且包装的λ噬菌体感染大肠杆菌要比质粒转化细菌的效率高得多，所以λ噬菌体载体常用于构建cDNA文库或基因组文库。

4、但λ噬菌体载体的克隆操作要比质粒载体复杂。理论上的极限值可达23kb，但事实上较为有效的克隆范围仅为15kb左右4、λ噬菌体载体的应用建立cDNA文库cDNA与载体重组，或经体外包装成噬菌体颗粒后转导宿主细胞，或不经体外包装直接转染宿主细胞，但转导的效率较高克隆外源目的序列为了使外源基因能有效转录，将其插入λDNA的PL启动子或PR启动子的有效转录区内（二）M13噬菌体克隆载体1、M13噬菌体的生物学特性外型呈丝状，由外壳包装蛋白和正链DNA组成2700个外壳蛋白分子M13噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长M13DNA为环状单链DNA分子，长6407核苷酸，至少有10个基

5、因，以及1个基因间隔区（IS区）复制起始位点在基因间隔区内M13DNA载体的特点使克隆的DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外（因为M13噬菌体只包装+链），这在DNA定向突变中非常有用M13重组分子筛选简便，被M13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混浊斑，易于辨认挑选。而且重组分子越大，混浊斑的混浊度亦越大可产生大量的含有外源DNA插入片断的单链分子，便于作探针或测序但M13--DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有1.5kb第三节cosmid克隆载体噬菌体-质粒杂合载体（黏粒载体）P461、构建cosmid克隆载体的策略cosmid克隆载体，实际上是质粒的衍生物，是

6、带有cos序列的质粒。研究发现，只要保留λDNA片断两端不少于280bp并含有cos位点以及与包装相关的核苷酸序列，DNA总长大于36.4kb，小于51kb，就能进行有效地包装和转导。“cosmid”一词是由英文“cossite-carryingplasmid”缩写而成的，其原意是指带有粘性末端位点(cos)的质粒。因此我们说，所谓柯斯质粒，乃是一类由人工构建的含有噬菌体DNA的COS序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。cosmid克隆载体：由质粒和含有cos位点的λDNA片断组装的一类新型克隆载体。柯斯质粒的特点它们兼具有λ噬菌体的高效感染能力和质粒易于克隆选择的优点

7、，既能像质粒一样在寄主细胞内复制，也能像λDNA一样被包装到噬菌体颗粒中去。其克隆能力为31~45kb，而且能够被包装成为具有感染性能的噬菌体颗粒。2、cosmid克隆载体的特征环状dsDNA分子，一般在10kb以下λ噬菌体的特性：可以高效地转导对噬菌体敏感的大肠杆菌寄主细胞。含有一个cos位点，能提供体外包装必需的cos末端。质粒的性质：能承载外源片断，转化大肠杆菌，并在其中自行复制和维持高容量的克隆能力：分子量较小，能承载比较大的外源片断，被广泛地应用于构建基因组文库质粒载体的克隆极限可达45kb左右第四节人工染色体（P4