第10章 基因工程相关技术ppt课件.ppt

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1、第十章基因工程相关技术第一节核酸分子杂交技术根据核酸变性和复性的性质，应用核酸探针检测靶基因或靶序列的技术方法，是分子生物学领域应用最为广泛的技术之一。具有灵敏度高、快捷、简便易行等优点，被广泛应用于基因克隆的筛选、酶切图谱的制作、基因序列的定量和定性分析以及基因突变的检测等。一、核酸杂交的原理利用具有同源性的两条核酸单链在一定的条件下退火，可按碱基互补原则形成双链，如果这两条链的来源不同，则形成杂交分子。核酸分子杂交实验通常包括两步：核酸印迹（nucleicacidblotting）转移：将核酸样品转移到固体支持

2、物滤膜上。主要有电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法（dotandslotblotting）、菌落和噬菌斑印迹法（colonyandplaqueblotting）；杂交反应：将具有核酸印迹的滤膜与带有放射性标记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。所以有时也称这类核酸分子杂交为印迹杂交。二、核酸探针的制备核酸分子探针:是指特定的已知核酸片段，能与互补核酸序列退火杂交，因此可以用于待测核酸样品中特定基因顺序的探测。要实现对核酸探针分子的有效探测，必须将探针分子用一定的示踪物（即标记物）进行标记。探针的种类及其选择根

3、据来源及其性质:基因组DNA探针：cDNA探针：RNA探针：人工合成的寡核苷酸探针注意:并不是任意一段核酸片度都可以作为探针的。探针的选择正确与否，会直接影响杂交结果的分析。各种标记物及其选择一种理想的探针标记物，应具备以下几种特性：①标记前后探针的基本结构不变，标记物不影响探针的化学性质、杂交特异性、Tm值等；②可以通过采取一定措施达到较高的灵敏度（如延长曝光时间或用增感屏来增加讯号的强度）；③特异性强、本底低，重复性好，并且操作简单、省时；④稳定、安全、经济、无污染。目前用于分子杂交的探针标记物已有20多种，可

4、分为放射性和非放射性两大类。①容易造成放射性污染；②当标记活性极高时，放射线会造成核酸分子结构的破坏；③多数放射性核素的半衰期都比较短，必须随用随标记，标记后立即使用，不能长期存放（3H与14C除外）。1.放射性核素放射性核素的灵敏度极高，可检测到10－4~10－18g的物质，但存在以下缺点：2.非放射性标记物生物素（biotin）、地高辛配基（digoxigenin）、荧光素等多数非放射性标记探针的敏感性较差，但稳定性好、分辨力高、检测所需的时间短，尤其是操作过程中不需要放射性防护设备，在安全方面大大优于放射性标

5、记探针。（三）探针的标记方法放射性标记分为体内标记法及体外标记法两种，而基因工程中常用体外标记。体外标记法又分为化学法和酶法两种。化学法是通过标记物的活性基团与核酸分子中的某种基团发生化学反应进行标记，标记物直接与核酸分子相连。酶法标记是先将标记物标记在核苷酸上，然后在通过酶促聚合反应使带有标记的核苷酸掺入到核酸序列中，产生标记核酸探针。常用的酶法标记有切口平移法（nicktranslation）和随机引物法（randompriming），这两种方法均为均一标记。此外还有一种是利用多核苷酸激酶的末端标记法，为不均匀

6、标记。1.切口平移法2.随机引物法随机引物法优点：①模板的纯度不需很高即可标记；②反应比较稳定，可通过延长反应时间来增加探针产量；③标记探针的比活较高，可达到4×109cpm/μg；④该法可以在低熔点的琼脂糖中进行。3’末端标记可使用末端转移酶，[α-32P]dNTP加到寡核苷酸的3’末端，可以加上单个或多个标记物，多个标记物的加入可以提高探针的比活。5’端标记，标记物常用[γ-32P]ATP。T4多聚核苷酸激酶3.末端标记法非放射性标记探针的检出目前大多数非放射性探针的制备都是采用分子杂交与酶反应结合的策略，杂交

7、信号的检出依赖于酶反应，其中酶直接标记的探针可直接通过酶反应检测。三、核酸杂交种类与方法（1）固相杂交，也称为膜上印迹杂交，包括Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、斑点杂交及狭缝印迹杂交。（2）细胞原位杂交，标记已知序列的核酸，与细胞或组织切片中的核酸进行杂交，并对其进行检测的方法。（3）液相杂交。膜上印迹杂交膜上印迹杂交是指将待测核酸序列片段结合到一定的固相支持物上，然后与存在于液相中标记的核酸探针进行杂交的过程，是目前最常用的一种核酸分子杂交方法。这种膜上印迹杂交的技术也称印迹技术。根据核酸分子

8、的种类不同，印迹技术（或方法）分为Southern印迹和Northern印迹。根据核酸转移方式的不同也有不同的印迹方法：①斑点或狭缝印迹法；②虹吸转移印迹方法；③电转移印迹方法；④真空转移印迹方法。印迹杂交实验中，选择有效的转移方法和良好的固相支持物此项技术成败的关键。1.固相支持物的选择固相支持物种类很多，一种良好的固相支持物应具备以下几个特点：①具有较强