《基因工程相关技术》PPT课件

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1、第八章基因工程相关技术第一节RNAi第二节基因芯片第三节基因信息分析技术90年代初，RichJorgensen设想，将更多的色素基因mRNA注入植物体，能使花朵的色彩更艳丽，而结果出其预料，转基因的植株不仅没有新基因表达，反而使原有的色素基因也受到了抑制，当时称共抑制（cosuppression)。第一节RNAi一、RNAi的发现历史par21基因反义RNApar21基因正义RNApar21基因沉默par21基因沉默秀丽新小杆线虫(C.elegans)1995年美国康奈尔大学Guopar21基因功能：控制

2、极性的建立1998年华盛顿卡耐基研究院Fire等发现这种现象是由于在制备正义/反义RNA时混入了少量的dsRNA纯化par21基因反义RNA纯化par21基因正义RNApar21基因沉默现象微弱par21基因沉默现象消失秀丽新小杆线虫(C.elegans)结论:dsRNA具有转录后抑制作用二、RNAi的定义RNAi(RNAinterference,RNAi)指将与内源性mRNA互补的dsRNA(doublestrandedRNA,dsRNA)导入细胞后,引起该mRNA特异性的降解，导致mRNA编码的基因不

3、能表达，发生基因沉默。切割AssembleintoRISCComplexSmallInhibitingRNA(siRNAs)PerfectBase-pairingtomRNAAAAAAAmRNACleavageandDestruction21dsRNADicerRISC(RNAinducedsilencingcomplexes)RNA诱导的沉默复合体三、RNAi的原理核酸酶RNaseIII核酸酶*DicerdsRNA的核酸酶——属于RNaseIII核酸酶家族成员，称为Dicer，是一种ATP依赖性核酸内切

4、酶。它包括2个催化区、1个解旋酶区及dsRNA结合区域，在进化过程中高度保守。该酶将dsRNA切割成长21-23nt,此片段的3’端有2nt的突出尾。*RNA诱导的沉默复合体RNA-inducedsilencingcomplex(RISC),复合体由21-23ntdsRNA、核酸酶和mRNA组成。当RISC复合物形成，核酸酶降解mRNA。kb=千碱基kilobasent＝核苷酸nucleotidebp＝碱基对basepairM7GpppAAAA依赖RNA的RNA聚合酶ProcessingofnewdsRN

5、AbyDicerM7GpppAAAA四、RNAi的细胞内级联反应SmallInhibitingRNA(siRNAs)RNAi基因表达的效应可以突破细胞的界限，在不同的细胞甚至生物体间传递和维持，并可传递给子一代。五、RNAi的细胞间级联反应InjectdsRNASeeRNAiresponsehere六、RNAi的应用1、防御病毒的感染：dsRNA出现在许多病毒（包括单链RNA病毒）感染的细胞内，诱发RNAi，封闭病毒生存和繁殖所必需的基因，产生抗病毒效应。2、基因治疗：RNAi作用的高度特异性有可能特异地

6、抑制致病的突变等位基因，但又不影响正常的等位基因。肿瘤是多个基因相互作用的基因网络调控的结构，传统技术诱发的单个癌基因的阻断不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长，而RNAi可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性，设计针对这一序列的dsRNA分子，只导入一种dsRNA既可以产生多个基因同时沉默。3、研究基因的功能：由于RNAi可以特异性抑制特定的基因，获得功能丧失，因此可用于功能基因组的研究。基因打靶七、SmallInhibitingRNA(siRNAs)siRNA是一种短片段双链RN

7、A分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA。切割AssembleintoRISCComplexSmallInhibitingRNA(siRNAs)PerfectBase-pairingtomRNAAAAAAAmRNACleavageandDestruction21dsRNADicerRISC(RNAinducedsilencingcomplexes)RNA诱导的沉默复合体1、化学合成2、体外转录3、长片断dsRNAs经RNaseIII类降解(e.g.Dicer,E.coli,RNase

8、III)4、PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达5、siRNA表达质粒载体或者病毒载体在细胞中表达siRNAs八、SmallInhibitingRNA(siRNA)的制备(A)LongdsRNA(B)SyntheticsiRNA(D)Plasmid-basedshRNAvector(E)Virus-basedshRNAvector(C)DicedsiRNADicerMicroinjectionDicershRNAsiRNA