基因工程PCR技术ppt课件.ppt

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1、多聚酶链式反应扩增DNA片断★分子生物学研究中最强大的实验技术之一★　其本质是在体外模拟胞内DNA分子复制的过程美国科学家　穆利斯(K.B.Mullis)发明了PCR技术1993年诺贝尔奖一、多聚酶链式反应是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的ＤＮＡ拷贝。广泛应用于遗传病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定等。二、DNA分子的结构1、基本组成单位——脱氧核苷酸脱氧核苷酸脱氧核苷磷酸脱氧核糖含氮碱基嘌呤嘧啶腺嘌呤（A）鸟嘌呤（G）胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（T）脱

2、氧核苷酸结构式35一个核苷酸上的磷酸基团上的“－OH”和另一个核苷酸分子的第三位碳原子上的羟基之间失去一分子水，形成磷酸二脂键，即在相邻的两个脱氧核苷酸的3’和5’碳原子之间形成磷酸二脂键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过3’、5’、磷酸二脂键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。通常将DNA的羟基“－OH”末端称为3’端，而磷酸基团的末端称为5’端。2、多脱氧核苷酸链的形成OOPOHO碱基OOHOOPOHOOH碱基5’3’3’5’碱基脱氧核糖磷酸基团碱基脱氧核糖碱基脱氧核糖5’3’多脱氧核苷酸链结构简图3、DNA分子的双螺旋结构特

3、点①DNA分子是由两条反向平行的（即一条链为3’－5’，另一条链为5’－3’）脱氧核苷酸长链盘旋而成的规则双螺旋结构。②脱氧核糖与磷酸交替连结，排列在外侧，构成基本骨架；碱基排列在链的内侧。③两条链上的碱基通过氢键连结起来，形成碱基对。碱基对的组成有特定的规律：即腺嘌呤一定与胸腺嘧啶配对，鸟嘌呤一定同胞嘧啶配对。三、DNA的复制2、时期有丝分裂间期或减数第一次分裂前的间期3、场所细胞核（主）（线粒体、叶绿体）4、模板DNA母链1、概念由一个DNA形成两个完全相同的DNA的过程5、原材料脱氧核苷酸6、基本条件酶、ATP、原

4、料、模板7、复制过程①DNA的解旋亲代DNA分子利用细胞提供的能量在解旋酶的作用下氢键断裂，部分双螺旋链解旋为两条平行的双链②RNA引物的合成以单股DNA为模板，在引物酶的作用下合成小段的RNA引物。③DNA的生成以单股的DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下，在RNA引物的末端由5’端→3’端合成DNA。边解旋边复制(过程）8、复制特点半保留复制（结果）9、遵循原则碱基互补配对原则10、精确复制的原因11、复制的意义DNA分子通过复制使遗传信息从亲代传给了后代，从而保持了遗传信息的连续性。①规则的双螺旋结构为复制提供了精

5、确的模板②碱基互补配对能力保证了复制准确无误的进行参与的组分在DNA复制中的作用解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物总结：胞内DNA复制的基本体系打开DNA双链提供DNA复制的模板合成子链的原料催化合成DNA子链使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸四、PCR(多聚酶链式反应）1、PCR原理①在80－100℃的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性。②当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链。③PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与

6、结合，现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器。变性复性延伸加热到90℃，DNA双链解旋为单链降到50℃，引物通过碱基互补配对与单链DNA结合升温到72℃，四种脱氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链2、细胞内和细胞外DNA复制环境的区别体内DNA的复制体外的模拟模板（母链）引物4种脱氧核苷酸DNA聚合酶反应环境细胞内源引物合成酶细胞内源细胞内源细胞内环境外源加入外源加入外源加入外源加入缓冲液①PCR过程需要的引物不是RNA，而是人工合成的DNA单链，其长度通常为20－30个脱

7、氧核苷酸。3、细胞内复制和PCR的主要不同点②PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的。4、DNA聚合酶特性不能从头合成DNA，只能从DNA的3′端开始延伸DNA链，因此，DNA复制需要引物。5、DNA聚合酶作用过程当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。高温解决了打开双链的问题，但又导致DNA聚合酶失活的问题，耐高温的TaqDNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活，促成了PCR技术的自动化。

8、6、TaqDNA聚合酶的应用7、缓冲液需要为PCR反应提供的物质DNA模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，耐热的DNA聚合酶存在于缓冲液中，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等特性