基因工程基本技术原理PCR课件.ppt

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1、第三节PCR技术原理PCR（polymerasechainreaction）是指模拟体内DNA复制的方式在体外选择性的扩增DNA某个特殊区域的技术.PCR是80年代发展起来的新技术，广泛应用于分子生物学、基因工程和其它与DNA鉴定相关领域，如疾病检测、临床应用、商品检疫、法医鉴定、新药品的开发等。返回第二章2.3.1核酸体外扩增最早的设想由Khorana及其同事于1971年提出：“经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重视该过程便可克隆tRNA基因”。但由于当时很难进行测序和合成寡核苷酸引物，且当时(1970年)

2、Smith等发现了DNA限制性内切酶，使体外克隆基因成为可能，所以，使Khorana等的早期设想被人们遗忘。2.3.2聚合酶链反应的发明1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人才发明了聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR),其原理类似于DNA的体内复制。开始是使用大肠杆菌DNA聚合酶。耐热DNA聚合酶的应用使PCR反应更易于自动化。PE-Cetus公司推出的第一台PCR热循环仪，使该技术的自动化成为现实。PCR具有划时代意义，Mullis等因此项技术于1993年获得诺贝尔化学奖PCR传奇《自

3、然》周刊1976年的《细菌学杂志》（JournalofBacteriology）：台湾钱嘉韵（AliceChang）文献耐热DNA聚合酶《科学》周刊先后拒发表《酶学方法》（MethodsofEnzymology）：吴瑞1983年春天的一个周五晚上，Mullis开车带着女友前往乡间的小屋度周末。在蜿蜒的乡间公路上开着车，一段DNA反复复制的景像，在他的脑海里冒了出来。PE-Cetus公司与MullisCetus70年代以制造维生素及抗生素为主开始转型，进入80年代以基因产品为主的研发：生长激素、胰岛素、凝血因子、干扰素、白介素等2.3.3

4、PCR原理基本原理：即DNA合成的基本原理基本要素：teplate/primer/DNApolmeraseTemplate:ssDNAordsDNAPrimers:oligo-nucleotides等Substrates:dNTPDNApolymerase:Taqpolymerase5’amplicon3’3’5’94℃37℃72℃Cycle12分子Cycle24分子Cycle38分子2.3.4PCR反应过程①变性:将模板DNA置于95℃的高温下，使双链DNA的双链解开变成单链DNA；②退火:将反应体系的温度降低至55℃左右，使得一对引

5、物能分别与变性后的两条模板链相配对；③延伸:将反应体系温度调整到TaqDNA（耐热）聚合酶作用的最适温度72℃，然后以目的基因为模板，合成新的DNA链。如此反复进行约30个循环左右，即可扩增得到目的DNA序列。一般需使用一对引物新合成的链又可作为模板94℃4min94℃1min4℃+∞72℃10min72℃1min65℃1min变性退火延伸30循环2.3.5PCR反应体系缓冲液buffer（1×）：50mMKCl引物退火10mMTris.HClpH8.3-9.01.5mMMgCl2(0.5-2.5)dNTP：终浓度0.2mM(即饱和浓度

6、)（pH7.0）4种dNTP应平衡，提高忠实性使用时应考虑Mg2+，引物，产量之间的关系如序列分析和制备探针时，用20-40mm引物：各1mm，即1pmol/mlOD260=1时:dsDNA50mg/ml（molecularcloning）ssDNA40mg/mloligo33mg/ml引物与退火温度：长度至少16bp，通常20-30bpTm=81.5-16.6log[J+]+0.041(G+C)%-(600/N)N：链长J：单价离子浓度若N=20G+C%=55%[J+]=60mmol/L，则：Tm=81.5-20.3+22.6-30=

7、53.8简单计算Tm=（G+C）×4+（A+T）×2（用于较短引物）还可从internet计算避免二级结构的形成二聚体二级结构G/C和A/T分布尽管均匀，一般G+C%45-55%OligodT/oligodC除外其它，如5’末端，限制酶位点的长度随机引物10-12bp引物设计原则：模板50μlPCR反应体系中模板DNA推荐使用量2.3.6PCR的相关技术逆转录PCR(retrotranscriptionPCR,RTPCR)指的是以RNA为模板，经逆转录获得与RNA互补的DNA链即cDNA，然后以cDNA链为模板进行的PCR反应。锚定PC

8、R(anchoredPCR)适合于扩增那些只知道一端序列的目的DNA。例如，对于一端序列已知、一端序列未知的DNA片段，可以通过DNA末端转移酶给未知序列的那一端加上一段多聚dG的尾巴，然后分别用多聚dC和