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时间:2018-08-06
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1、PCR技术的基本原理 PCR技术的基本原理 类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成: ①模板DNA的变性:模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备; ②模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合; ③引物的延伸:DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为
2、反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。(Plateau)。到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。 PCR的反应动力学 PCR的三个反应步骤反复进行,使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA扩增量可用Y=(1+X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数,X表示平(Y)均每次的扩增效率,n代表循环次数。平均扩增效率的理
3、论值为100%,但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期,靶序列DNA片段的增加呈指数形式,随着PCR产物的逐渐积累,被扩增的DNA片段不再呈指数增加,而进入线性增长期或静止期,即出现“停滞效应”,这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下,平台期的到来是不可避免的。 PCR扩增产物 可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5'端之间,是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的,以一个原始模板为例,在第一个反应周期中,
4、以两条互补的DNA为模板,引物是从3'端开始延伸,其5'端是固定的,3'端则没有固定的止点,长短不一,这就是“长产物片段”。进入第二周期后,引物除与原始模板结合外,还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结时,由于新链模板的5'端序列是固定的,这就等于这次延伸的片段3'端被固定了止点,保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加,而“长产物片段”则以算术倍数增加,几乎可以忽略不计,这使得PCR的反应产物不需要再纯化,就能保证足够纯DNA片段供分析 1.Polymerase
5、ChainReaction具体内容点击:聚合酶链式反应,简称PCR。又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。由美国科学家PE(PerkinElmer珀金-埃尔默)公司遗传部的Dr.Mullis发明,由于PCR技术在理论和应用上的跨时代意义,因此Mullis获得了1993年化学诺贝尔奖。是一种体外快速扩增DNA的方法,用于放大特定的DNA片段,数小时内可使目的基因片段扩增到数百万个拷贝的分子生物学技术。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤
6、构成:①模板DNA的变性:模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;②模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;③引物的延伸:DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基互补配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链,重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次
7、循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。所有的DNA的复制都是从一个固定的起始点开始的,而DNA聚合酶只能延长已存在的DNA链,不能从头合成DNA链,新DNA的复制是如何形成的?经大量实验研究证明,DNA复制时,往往先由RNA聚合酶在DNA模板上合成一段RNA引物,再由聚合酶从RNA引物3’端开始合成新的DNA链。引物科技名词定义中文名称:引物英文名称:primer定义1:在聚合作用的起始时,可以刺激合成另一种大分子,并与反应物以共价键形式连接的序列。在核酸化学中,引物是一段短的单链RNA或DNA片段,可结合在核
8、酸链上与之互补的区域,其功能是作为核苷酸聚合作用的起
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