《基因工程》第六章 PCR技术ppt课件.ppt

《《基因工程》第六章 PCR技术ppt课件.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、第六章聚合酶链反应PolymeraseChainReaction主要内容PCR技术简史概念原理反应过程反应主要成分几种特殊形式的PCR反应PCR的应用PCR技术简史1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了……1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的

2、DNA复制最初采用E-coliDNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖PCR技术简史KaryB.Mullis<>1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔

3、化学奖。聚合酶链反应又称“体外的基因扩增”,是由美国PE-Cetus公司和加利福尼亚大学于1985年共同合作开发的一项基因工程技术。这一技术可以在几个小时内将pg（10-12g）水平的单链拷贝序列扩增至上百万倍，已广泛地在许多领域得到了应用。1.1基本原理PCR的基本原理是利用聚合酶依赖于模板的特性，在体外模仿体内天然的DNA复制过程。复制过程被限定在一对人工合成的寡核苷酸之间。这段寡核苷酸被称为“引物”，长度通常为20个核苷酸。1.1.1反应过程PCR反应主要包括三个步骤：1）DNA变性（denature，DNAm

4、elted）加热使模板DNA双链解离，形成两条单链的过程；2）引物退火（primerannealing）即将反应温度降低，使两个引物分别与变性的两条模板DNA单链的3′—端配对，这一过程也被称为复性；3）延伸（extension）在四种脱氧三磷核苷存在的条件下，由DNA多聚酶催化，使引物沿模板DNA单链的3′→5′方向延伸，合成出一条新的DNA链。整个过程总结于下图中。图聚合酶链反应简图退火（50ºC）延伸（72ºC）变性（94ºC）变性（94ºC）退火（50ºC）延伸（72ºC）变性（94ºC）靶序列扩增（25-3

5、0次）PCR反应的混合物由DNA模板，过量的引物，dNTPs和一种热稳定的DNA聚合酶组成。加热混合物至DNA模板的双链解开成为单链。然后，冷却至引物退火与DNA模板单链结合。当然，解开的DNA模板也可能自我退火，重新合成双链，但是，过量的引物可以降低这种可能性。在DNA聚合酶的作用下，利用反应体系中的dNTP合成新的互补链，形成双链DNA分子反复重复上述过程，可以使靶DNA得到扩增。PCR的扩增倍数=（1+x）n，这里的x是指平均扩增效率，n为循环的次数。DNA扩增的过程符合酶催化动力学原理。在扩增的初期，扩增的量

6、呈直线上升，但是当引物—模板／聚合酶达到一定比值时，酶的催化反应趋于饱和。这时，便出现所谓的“平台效应”，即靶DNA产物的浓度不再增加。起始的靶DNA的拷贝数越多，PCR扩增的效率较高，则达到平台期所需的循环次数越少。如果按75%的效率计算，单一拷贝的基因，经过25-30轮循环，基因拷贝数就应超过100万。但因多种因素的影响，实际的效率要比这一估计低。一般长度为2kb的靶DNA可在30—35次循环后从起始时10－6ug增加到1ug左右。如果这种方法用于扩增基因组DNA（称这种DNA为全长度分子，“full－lengt

7、hmolecule”），那么第一轮后，百分之五十的分子将是全长度分子，另外一半的分子的一端从引物开始，另一端将由DNA聚合酶行进的距离决定，这种分子被称为半长度分子（half－lengthmolecule）。在下一轮，每个全长度分子将产生一个全长度分子和一个半长度分子，每个半长度分子将产生一个半长度分子和一个确定长度的靶分子（长度在两个引物位点之间）。每循环一次，全长度分子数保持恒定，半长度分子数以算术级数增加，而靶分子数则以几何级数增加。经过多次循环后，PCR产物在凝胶电泳上显示的是单一靶DNA分子的群体。1.1.

8、2反应物主要成分1．寡聚核苷酸引物2．DNA模板3．dNTPs4．聚合酶1．寡聚核苷酸引物较理想的寡聚核苷酸引物长度应在20--40bp之间。引物太短时（<16bp）降低引物与靶DNA在复性温度下结合的效率。0.1—1umol/L的引物一般可维持30次左右次循环过程中的消耗。如果引物浓度过高，可导致无关序列的扩增。浓度过低，靶DNA易发生自身退