《基因工程常用技术》PPT课件

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1、第三章基因工程常用技术一、质粒DNA的提取二、核酸凝胶电泳技术三、核酸分子杂交技术四、聚合酶链反应(PCR)技术五、DNA序列分析技术1质粒DNA的提取是基因工程操作中最基本的技术，最常用的是碱裂解法。一、质粒DNA的提取2在强碱性溶液中，DNA双链的氢键断裂变性；当溶液恢复中性时，DNA双链复性。（一）碱裂解法提取质粒DNA1、原理3在变性后双链不分离、复性快。共价闭合环状的质粒DNA：4强碱性变性后双链分离、难以复性而形成缠绕结构，与蛋白质-SDS复合物结合在一起，离心时沉淀。线性染色体DNA：52、碱裂解法质粒DNA提取的步骤1）溶菌使用“溶液I”溶解细菌细胞壁。溶液I：50m

2、M葡萄糖25mMTris-HCl(pH8.0)10mMEDTA4-5mg/ml溶菌酶6葡萄糖：增加溶液粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力的作用而降解（震荡）。EDTA：Mg2+、Ca2+螯合剂，抑制DNase活性，防止DNA被降解。7溶菌酶：为糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分--肽聚糖中的-1,4糖苷键，具有溶菌作用。82）变性加入“溶液II”，使细菌细胞膜破坏、使蛋白质和DNA变性。溶液II：0.2NNaOH（10N贮存液现用现稀释）1%SDS9NaOH：是强碱，提供pH>12的碱性条件，使DNA双链变性。是离子型表面活性剂，溶解细胞膜和细胞内蛋白，并结合成“蛋白质-

3、SDS”复合物，使蛋白质（包括DNase）变性沉淀。SDS：103）中和加入“溶液III”使DNA复性、蛋白质-SDS复合物和染色体DNA、RNA沉淀。溶液III：5NKAc60ml冰HAc11.5ml水8.5ml11KAc：用冰HAc把KAc溶液的pH调到4.8，以中和NaOH变性液，使DNA复性。高浓度KAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA、蛋白质-SDS复合物沉淀。冰HAc：12上清液中含有质粒DNA。4）离心去除沉淀135）纯化DNA酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）抽提或柱层析。14酚：比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中的酚。蛋白变性剂，进一步抽提DNA

4、溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。防止抽提时振荡起泡。氯仿：异戊醇：152倍体积的无水乙醇沉淀DNA。6）沉淀DNADNA分子以水合状态“溶于”水里，乙醇能夺去DNA分子的水环境。1670%乙醇洗涤DNA，干燥。7）洗涤8）贮存用含RNaseA(20g/ml)的TE溶解DNA，贮存于-20℃。17TE：由Tris-HCl缓冲液和EDTA配制。EDTA抑制DNase，防止DNA被酶降解。Tris-HCl不含金属离子（不同于磷酸或硼酸缓冲液），利于后续操作。RNaseA：降解残留的RNA。18许多公司研制出商品化质粒提取试剂盒，原理大多依照碱裂解法，但在纯化步骤上采用柱层析。193、影响质

5、粒DNA产量的因素质粒的产量受提取过程中各因素的影响，但最重要的是菌株的遗传背景和质粒自身的拷贝数。20一般使用endA基因突变的E.coli菌株，如DH5、JM109等。1）受体菌株endA基因编码核酸内切酶I，在Mg2+存在下，可将双链DNA消化为7bp的寡核苷酸片断。21是直接决定DNA产量的重要因素之一。2）质粒拷贝数3）质粒大小分子量大的质粒拷贝数低。22常用质粒的理论产量pUCpGEMpBR322ColE1pSC1012.7kb2.7kb4.4kb4.5kb9.0kb500-700300-700>25>15≈62.9-4.11.8-4.1>0.32>0.15≈0.12质

6、粒分子大小拷贝数质粒产量（kb）（g/ml）23（二）DNA的定量和纯度测定1、紫外光谱法原理：基于DNA在260nm波长处有特异的紫外吸收峰（蛋白质在280nm处有吸收峰），用微量比色杯在紫外分光光度计直接测定。24在波长260nm紫外光下，1OD值的吸光度相当于双链DNA浓度为50g/ml。25纯DNA样品：OD260/OD280=1.8OD260/OD230>2.0OD260/OD230<2.0：有残存的盐和小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。OD260/OD280<1.6：有蛋白质污染；OD260/OD280>1.9：有RNA污染；26原理：利用溴化乙锭(EB)能插入DN

7、A分子中，在紫外光照射下能发红色荧光，将其荧光强度与已知浓度的DNA(如DNAmarker)电泳条带对比，可估算出DNA含量。2、琼脂糖凝胶电泳估计27（三）DNA分子量的估计通过琼脂糖凝胶电泳，与已知分子量的DNAmarker对比得知。28二、核酸凝胶电泳技术（一）电泳的基本原理生物大分子在一定pH条件下，通常带电荷，将其置于电场中，会以一定的速度向与其电荷性质相反的电极迁移，迁移速度称电泳速率。29摩擦系数与分子的大小、构型及介质的粘度有关。电泳速率与