《基因操作原》ppt课件

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1、第二章基因操作的主要技术原理核酸的凝胶电泳扩增原理分子杂交测序核酸的凝胶电泳它是一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段，同时也是分子生物学研究方法的技术基础。基本原理带有负电荷的DNA或RNA核苷酸链，依靠无反应活性的稳定的介质（琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶）和缓冲液，在电场中以一定的迁移率从负极移向正极。根据核酸分子大小不同、构型或形状的差异，以及所带电荷的不同，可以通过电泳将其混合物中的不同成分彼此分开。电泳的迁移率取决于核酸分子本身的大小和构型。分子量较小的DNA分子，比分子量较大的DNA分子迁移

2、率要快；同等分子量的不同构型的核酸分子，构型紧密的比松散型的开环DNA分子或线性DNA分子迁移率要快凝胶电泳的分辨力：与凝胶的类型和密度相关琼脂糖凝胶的分辨力在0.2～50Kb之间;聚丙烯酰胺的分辨力在1～1000bp之间琼脂糖凝胶电泳琼脂糖是一种从红色海藻中提取出的线性多糖聚合物。分为常熔点的琼脂糖和低熔点（LMP）琼脂糖。LMP琼脂糖熔点：62～65℃熔解后，在37℃可保持液态数小时；在25℃可保持液态约10min回收DNA分子在65℃下将LMP琼脂糖凝胶熔化；加入过量的酚抽提DNA；离心获得含DNA分子的上清液；直接酶

3、切琼脂糖凝胶电泳的参数：缓冲液：1×TAE（TBETPE）凝胶的含量：根据检测的DNA大小加DNA样品：<1μg，指示剂电泳条件：大片断低电压长时间，小片段高电压短时间染色和观察：溴化乙锭（ethidiumbromide，EB）染色，在300nm波长的紫外下观察（凝胶成像仪）。能看到0.05μg的微量DNADNA的片断大小与荧光强度成正比SeparationRangeVs.%AgaroseLowGelingAgarose4-60.02-0.4用已知分子量的标准DNA对DNA片断大小的估算SampleWell25ng1kbla

4、dder0.8%Agarose124681012kbAgaroseGelElectrophoresisEtBrDetectionLimit:~5-10ngDNA根据标准DNA相对迁移距离推测待测定的DNA片段的大小AgarosegelelectrophoresisAgarosegelelectrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲液：TBE凝胶聚丙烯酰胺：丙稀酰胺/亚甲双丙稀酰胺（29：1）；TEMED和过硫酸铵（10％）。PolyAcrylamideGels脉冲电场凝胶电泳（PFGE）1984年，D.R.Cantor发

5、明的。分离超大分子量的DNA分子。在脉冲电泳中，电场方向是周期变化的，头一个脉冲电场方向与核酸的移动方向成45℃角，下一个脉冲的电场方向与核酸移动方向在另一侧成45℃角，由于加在琼脂糖凝胶电泳上的电场方向、电流大小、以及作用时间都在交替地变换着，这就使得DNA分子必须随时调整其泳动的方向，来适应凝胶孔隙的无规则变化。与分子量小的DNA分子相比，分子量大的DNA分子需要较多的次数来更换其构型和方位，使之能够按新的方向游动，所以迁移率就慢，从而达到了分离大分子量DNA分子的目的。在脉冲电泳中，电场方向是周期变化的，头一个脉冲电场

6、方向与核酸的移动方向成45℃角，下一个脉冲的电场方向与核酸移动方向在另一侧成45℃角，由于加在琼脂糖凝胶电泳上的电场方向、电流大小、以及作用时间都在交替地变换着，这就使得DNA分子必须随时调整其泳动的方向，来适应凝胶孔隙的无规则变化。与分子量小的DNA分子相比，分子量大的DNA分子需要较多的次数来更换其构型和方位，使之能够按新的方向游动，所以迁移率就慢，从而达到了分离大分子量DNA分子的目的。107bp的DNA大分子。PFGEcanresolvelargeDNAfragments基因扩增（geneamplification）

7、主要内容：1.体外扩增2.通过体外重组和转化，将目的基因在宿主细胞进行扩增3.在环境作用下，生物体内相关基因的扩增。4.程序基因扩增5.进化过程中的基因扩增PCR技术在1983年，美国Cetus公司人类遗传研究室的科学家K.B.Mullis发明的。PCR是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，有称之为体外扩增法。(c)(b)引物25’3’3’3’5’5’(d)新引物5’3’靶DNA的扩增(a)5’3’引物13’5’3’5’引物2互补链引物1互补链单位长度的链不同长度的链5’3’3’5’引物1互补链引物2互补链目的片段

8、（不同长度的链未示出）聚合酶链式反应示意图(e)(f)(g)温度（℃）时间（min）94726094℃变性（1min）60℃退火（1min）72℃延伸（1.5min）循环1循环2循环3PCR反应的温度循环周期PCR反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。