第二章基因操作的主要技术原理-3

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1、第五节基因的化学合成1基因化学合成的概况随着基因工程的发展，需要定向地修改、设计生物基因组，快速合成DNA片段的方法显得十分重要。1957～1965年H.G.科拉纳等人设计并合成了由一种、两种或3种脱氧核苷酸组成的重复顺序的脱氧寡核苷酸片段，并以此为模板用DNA聚合酶和RNA聚合酶进一步复制和转录，得到了具有对应的互补顺序的长链人工信使核糖核酸(mRNA)，再用这种人工mRNA在无细胞体系中进行蛋白质合成。通过分析这样得到的多肽产物的氨基酸顺序和与模板中核苷酸顺序的对应关系破译了遗传密码。1977年,坂仓等人首先合成了生长激素释放抑制因子的

2、基因，并使之在大肠杆菌中实现了表达，得到了在大肠杆菌中原来并不存在的活性肽（十四肽）。1979年，Khorana在Science杂志上发表题为“一个基因的合成”的论文，报道了基因化学合成的成功事例。1981年中国生化学家王德宝等完成了酵母丙氨酸转移核糖核酸的全合成工作，这是第一个人工合成的具有全部生物活性的RNA分子。一系列多肽和蛋白质基因，如胰岛素、干扰素和生长激素等的基因相继被合成，并得到了很好的表达，使得这些原来只能从动物组织中得到的含量不多的蛋白质能以细菌发酵的办法大量生产。概念：以核苷或单核苷酸为原料并且不依靠任何天然模板或引物，

3、采用有机合成反应或酶促合成反应进行的寡核苷酸或核酸大分子的合成。核酸的人工合成在基因的化学合成中，首先要合成出有一定长度的、具有特定序列结构的寡核苷酸片段，然后再通过DNA连接酶的作用，使他们按照一定的顺序共价连接起来。干扰素基因就采用此方法合成。磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法，及在后二者基础上发展起来的固相合成法和自动化法。核酸合成包括化学合成和酶促合成两个方面化学合成以核苷或单核苷酸为原料，完全用有机化学方法来合成核酸。由于核苷酸是一个多官能团的化合物，因此,在化学合成中,必须将不希望发生反应的基团保护起来。酶促合成通过酶促反应可

4、以把化学合成的小片段连接成为大片段，或是从已经合成的单链制成双链，它可以加快合成工作的进展，使人工合成核酸大分子的目标得以顺利地实现。　　大肠杆菌DNA连接酶和T4噬菌体DNA连接酶是两种经常使用的DNA连接酶。基本原理是将一个5’端带有适当保护基的脱氧单核苷酸与另一个3’端带有适当保护基的脱氧单核苷酸偶联起来，形成一个带有磷酸二酯键的脱氧二核苷酸分子。2磷酸二酯法由于以上反应是通过磷酸单酯和羟基缩合生成3′-5′磷酸二酯，故称为磷酸二酯（合成）法。能合成长达200bp的寡核苷酸片段但在磷酸二酯法中，由于产物为磷酸二酯，磷酸上所剩下的O

5、H基团，虽然化学活性较小,但也能发生反应,因此,当合成的寡核苷酸链逐渐增长时,由这个磷酸OH基团所带来的副反应也愈益严重，使合成产率急剧下降，目前这个方法已基本上被淘汰。改进的办法之一是采用适当的保护基把磷酸上的OH基团也保护起来，再进行连接反应。即如图4所表示的那样，用甲核苷3′-磷酸二酯（用R5保护磷酸上的OH基团）同乙核苷的5′-羟基反应生成磷酸三酯型的产物，这个方法称为磷酸三酯法。3磷酸三酯法4亚磷酸三酯法以保护的亚磷酰胺单体为原料，经1-H-四氮唑活化后与羟基组分连接，先生成亚磷酸三酯，再氧化得到磷酸三酯，称为亚磷酰胺法或亚磷酸三

6、酯法。4固相亚磷酸三酯法合成寡核苷酸在磷酸三酯法和亚磷酸三酯法基础上发展起来的固相合成法,其基本原理是将要合成的寡核苷酸链的3′末端核苷先固定在一个不溶性的高分子上面，然后再从此末端核苷开始，逐步接长，接长的链始终被固定在载体上，过量的未反应物和分解产物则通过过滤或洗涤除去，每接长一个经历一次循环。当整个链的增长达到所需要的长度后，再将寡核苷酸链从固相载体上切落下来并脱去保护基，经过分离纯化得到所需要的最后产物。固相合成不仅可以缩短合成的时间,提高总产率,并且由于每一个缩合循环都经过同样的操作步骤，因此可以采用自动控制手段。目前已经设计出多

7、种型号的全自动或半自动的合成机器，其每一次的连接产率达到97～99％，最快的每轮循环不到10分钟，最长的合成片段可到100核苷酸以上。原理是将所要合成的寡核苷酸链的3’末端先以3’-OH与一个不溶性载体，如多孔玻璃珠连接，然后依次从3’-5’的方向将核苷酸单体加上去，所使用的核苷酸单体的活性官能团都是经过保护的，其中5’-OH用4,4-二对甲氧基三苯基保护，3’-端的二丙基亚磷酸酰上的磷酸的OH，用保护基封闭合成的一个循环周期分四个步骤：1、脱三苯甲基作用用二氯乙酸或三氯乙酸处理，脱去核苷酸1的5’-OH基团偶联的保护基团DMT2、偶联反应

8、通过弱碱-四唑的催化反应，使第二个核苷酸同已附在固相载体上的核苷酸1的暴露5’-OH缩合。3、封端反应加入乙酸酐激发的乙酰化作用，把所有没有参与偶联反应的5’-OH基团全部封闭起