基因操作的主要技术原理（可编辑）

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1、硫酸二甲酯（DMS）足迹实验：DMS能使裸露的鸟嘌呤（G）残基甲基化，而六氢吡啶会对甲基化的G残基作特异的化学切割。而与蛋白结合的DNA片断上的G残基，不会被DMS甲基化，从而避开了六氢吡啶的切割作用。于是在DNA片断的序列中，不存在具这些G残基末端的DNA片断，出现了空白区。甲基化干扰实验（methyltioninterferenceassay）根据DMS（硫酸二甲酯）能够使G残基甲基化，而六氢吡啶又能够特异切割甲基化的G残基这一原理，设计出了另一种研究DNA与蛋白质相互作用的实验方法，即甲基化干扰实验。这种技术可以检测靶DNA中特异G残基的优先甲基化对而后的蛋白质结合作

2、用究竟会有什么效应，从而更加详细地揭示DNA与蛋白质之间相互作用的模式。DMS化学干扰的主要局限性是，它只能使G残基甲基化。尽管如此，它仍不愧为足迹实验的一种有效的补充手段，可以鉴定足迹区段中DNA与蛋白质相互作用的精确位置。具体操作如下页图所示。GGGGGGmⅠGGGⅢmGGGmⅡGGGmⅡGGGmⅠGGGⅢmDNA局部甲基化与蛋白质提取物混合与蛋白质结合不与蛋白质结合与蛋白质结合凝胶电泳与蛋白质结合的DNA带含有Ⅰ和Ⅲ两种类型DNA片段不能与蛋白质结合的DNA带含有全部三种类型DNA片段切除所有结合与不结合蛋白质的DNA带，并用六氢吡啶切割甲基化的G残基结合带非结合带缺

3、失的DNA带表明相应G残基的重要意义，它得到结合蛋白质的保护甲基化干扰实验4、体内足迹实验GG×GG×meGGGGMeMe完整的细胞裸露的DNADMS硫酸二甲酯分离DNA并用六氢吡啶切割凝胶分析PCR扩增受保护的G残基应用甲基化保护作用进行的体内足迹实验DNA核苷酸序列分析传统的DNA序列分析法：Sanger双脱氧链终止法和am-Gilbert化学分析法新发展的DNA杂交测序法PCR技术的应用：1.基因组克隆突变体的鉴定和在PCR过程中有目的的添加核算序列。反相PCR(reversePCR)与染色体步移不对称PCR(asymmertricPCR)用来制备单链的DNA特点：两

4、种引物的浓度不同，低浓度的限制引物和高浓度引物，两者浓度相差约100倍。获得单链核苷酸的另一种方法是通过固相支持物作DAN链的特意洗脱。（生物素―链霉素包裹的磁珠）RT－PCR:在mRNA反转录之后进行的PCR检测RNA分子；获取测序模板DNA；克隆mRNA之cDNA拷贝。基因的体外诱变基因组的比较研究：10个碱基作引物用随机引物扩增出的PCR产物，经琼脂糖电泳后所呈现的带型，反映着用作模板的DNA分子的总体结构特征。核酸分子杂交（DNA/DNAorDNA/RNA）技术核酸分子杂交技术，是在1968年由华盛顿卡内基学院（CavnegieInstituteofWashingt

5、on）的RoyBritten及其同事发明的。所依据的原理是，带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。杂种核酸分子：彼此退火的核酸来自不同的生物有机体，而形成的双链分子。DNA/DNA的杂交作用检测特定生物有机体之间的亲源关系DND/DNA或RNA/DNA的能力，揭示核酸片断中某种特定基因的位置。核酸杂交常用几种膜的性能比较硝酸纤维素膜不能滞留小于150bp的DNA片断，不能同RNA结合。应用1mol/L醋酸铵和0.2mol/L的NaOH缓冲液代替SSC缓冲液可改善对小片断DNA的滞留能力。RNA变性后也能十分

6、容易的结合到膜上。尼龙膜或硝酸纤维素膜杂交的步骤：1.核酸印迹转移：将核酸样品转移到固体支持膜上。利用的是毛细管作用2.印迹杂交：将具有核酸印迹的滤膜同带有标记的DNA/RNA进行杂交。1、萨瑟恩DNA印迹杂交根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段，这种实验方法叫做DNA印迹杂交技术。由于它是由E.Southern于1975年首先设计出来的，故又叫SouthernDNA印迹转移技术。印迹转移前的凝胶处理：分子量不同所需转移的时间不同；浸泡在0.25M的HCL溶液

7、中脱嘌呤，再进行碱变性碱水解，DNA链断裂单链（a）（b）（c）（d）（e）基因组DNADNA限制片段硝酸纤维素滤膜同探针同源杂交的基因DNA片段X光底片Southern凝胶转移杂交技术SouthernDNA印迹杂交之X光显像图片水稻（OryzasativaL.)的叶绿体DNA分别用核酸内切限制酶BglⅡ(A-C)、BamHⅠ（D-F）、EcoRⅠ（G-I）、和HindⅢ（J-L）消化，加样在含有EtBr染料的1%的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，然后同32P标记的玉米psbA探针作Southern杂交。X光底片中显现