第三章基因操作的主要技术原理

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1、第三章基因操作的主要技术原理第一节核酸的分离与纯化核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都是以与蛋白质结合的方式存在的真核生物95%DNA存在于细胞核内，5%在细胞器75%的RNA存在于细胞质，10%在核内，15%在细胞器rRNA（80～85%），tRNA及核内小分子RNA（10～15%），mRNA（1～5%）一、核酸分离提取的原则1.保证核酸一级结构的完整性2.排除其它分子的污染核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子将其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染降到最低排除其它核酸分子的污染核酸提取的基本要求尽量简化操作步

2、骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏减少化学因素对核酸的降解（过酸、过碱）减少物理因素对核酸的降解（机械剪切力、高温）防止核酸的生物降解提取核酸的一般程序:破碎细胞去除与核酸结合的蛋白质及多糖等去除其它核酸分子沉淀核酸，去除盐类、有机溶剂等杂质纯化核酸核酸的质量评估（电泳、D260/OD280，酶切）二、质粒载体的分离与纯化关键：如何使质粒DNA与宿主染色体DNA分开依据：质粒DNA比染色体DNA小得多，在DNA提取过程中，染色体DNA断裂成片段(线状)，而质粒DNA仍保持超螺旋构型变性法提取质粒DNA的原理在变性条件（碱性或高温)下，线

3、状染色体DNA变性成为单链而完全分开，而cccDNA虽然互补链之间的氢键断裂，但双螺旋主链骨架仍彼此缠绕在一起。当变性条件恢复时，质粒DNA迅速复性恢复天然构型，染色体DNA难以复性，交联形成不溶性网状结构，与变性的蛋白质和RNA缠绕在一起，通过离心沉淀下来，而质粒DNA存在于上清液中。碱变性法提取质粒DNA的步骤收集细胞沉淀加入溶液I(50mM葡萄糖,25mMTris-HCl,10mMEDTA,4~5mg/mL溶菌酶）加入溶液II(0.2MNaOH,1%SDS)加入溶液III(3MNaAcpH4.8)离心除去沉淀，得含质粒DNA的上清液苯酚抽提去除

4、蛋白质乙醇沉淀收集质粒DNA在强碱性环境中暴露时间过长，cccDNA可发生不可逆变性关键：尽可能地保持其高分子量细菌3300~4200kb酵母15,000kb果蝇1.65x105kb人3x106kb植物2x105~1x108kb天花病毒288kb痘病毒196kb三、染色体DNA的分离纯化CsCl密度梯度离心原理：CsCl介质密度为1.7g/cm3，超速离心后形成1～1.9052g/cm3的密度梯度EB（溴化乙锭）可嵌入DNA两条链的碱基对之间，并因此导致双螺旋结构发生解旋反应线性或开环DNA分子，因其具有游离的末端而易于解旋，故可结合相当大量的EB直

5、到达到饱和具有ccc结构的质粒DNA由于负超螺旋的存在阻止DNA解链，因而只能结合很少的EBDNA分子中结合EB越多，其浮力密度越小，因而形成不同的浮力密度得以区分质粒质粒DNA的分离纯化氯化铯密度梯度离心法：用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体加溶菌酶裂解细菌细胞壁加CsCl和溴乙锭超速离心过夜在紫外灯下吸取cccDNA稀释沉淀cccDNAproteinsocDNAL-DNAcccDNARNAs关键：防止内外源RNase的作用四、RNA的分离与纯化RNase的特点：抗酸抗碱,具很广pH作用范围抗高温严寒(0~65℃均具活性，100℃也不能使之完全失活）抗

6、变性剂（变性剂只能使之暂时失活，去除变性剂后又可恢复活性）酶活性不需要辅助因子存在范围广解决办法：外源RNase：高温（干热180℃，4hrs），焦碳酸二乙酯(DEPC)处理所有溶液（Tris·HCl除外）和器皿，操作者带手套内源RNase：高温抽提，强蛋白质变性剂，RNase抑制剂，蛋白酶K等五、核酸的浓缩与贮存沉淀是核酸浓缩最常用的方法，其最大的优点是通过核酸沉淀来改变核酸的溶解缓冲液及重新调节核酸在溶液中的浓度，可去除溶液中某些可溶性的盐离子与杂质，在一定程度上纯化核酸沉淀DNA的最常用方法是在DNA溶液中加入1/10体积的3MNaAc（或KA

7、c）和2倍体积的乙醇，放置15～30min，离心收集DNA沉淀，倒去上清液，加入70%的乙醇洗涤沉淀，去除残余的盐，再离心收集沉淀。贮存DNA：溶于TE中，放置于4℃、-20℃、-70℃RNA：溶于0.3MNaAc(pH5.2)或ddH2O中，-70℃长期保存可以沉淀形式贮存于乙醇中，-20℃六、核酸的质量评估方法核酸浓度的测定ds-DNA：1OD260≈50μg/mlss-DNA&RNA：1OD260≈40μg/ml单链寡核苷酸：1OD260≈20μg/ml核酸纯度的测定DNA：A260/A280=1.8若＞1.8，说明RNA未除尽＜1.6，蛋白质

8、或酚未除尽RNA：A260/A280=2.0＜2.0，蛋白质或酚未除尽第二节凝胶电泳一、核酸电泳的基本原理核