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1、基因操作原理重难点总结1・基因操作中常用工具酶是哪些？各有什么用处？答：基因操作中最常用的修饰酶有：（1）内切酶和外切酶：识别特定的DNA序列，切割单链或双链，产生黏性末端或平末端，与伴生的甲基化酶一起形成I、II、III三种限制修饰系统。英中基因操作中最常用的是II型系统，它们识别回文对称序列，在序列内部或附近切割DNA,产生带3=疑基和磷酸基团的DNA产物，需Mg时的存在才能发挥活性，相应的修饰酶只需SAMo（2）甲基化酶（每一种限制性内切酶都对应一种甲基化酶）：甲基化酶可在其识别位点内引入甲基，用
2、于保护DNA不被相应的限制酶所切割。通过甲基化修饰还可产生新的酶切位点。Dam甲基化酶可在GATC序列小的腺嚓吟N6位置上引入甲基。Dem甲基化酶识别CCAGG或CCTGG,在第二个胞圧密旋C的C5位置上引入甲基。（3）连接酶：®T4DNA连接酶可以催化DNA5-磷酸和丁-OH之间形成磷酸二酯键，用于DNA的粘性末端和平末端连接；②E.coliDNA连接酶作用需NAD'的参与，常用于DNA的.粘性末端连接和eDNA克隆；③T4RNA连接酶可以催化ssDNA或RNA的5»磷酸与另一ssDNA或RNA的3-
3、0H之I'可形成共价连接，可用于标记DNA和RNA的歹末端，单链DNA或RNA的连接；©TaqDNA连接酶：可在两个寡核营酸之间进行连接反应，同时必须与另一DNA链形成杂交体，相当于连接双链DNA中的缺口，需NA。可用与检测等位基因的变化及在PCR扩增中引入寡核昔酸，但不能替代T4DNA连接酶。（4）DNA聚合酶（依赖于DNA的DNA聚合酶）：大肠杆菌DNA聚合酶I具有三种活性：5，->3QNA聚合酶活性；5J3吻、切核酸酶活性；3J5外切核酸酶活性。利用其5J3,外切核酸酶活性可用切口平移法标记DNA
4、；用于克隆eDNA中的第二链;对3一突出末端的DNA作末端标记。用蛋白酶将大肠杆菌DNA聚合酶1裂解形成的KlenowDNA聚合酶具有聚合活性和外切核酸酶活性，可补平有3,凹端的DNA或抹平3,凸端，还可对DNA进行末端标记，在eDNA克隆中合成第二链。T4噬菌体DNA聚合酶与KlenowDNA聚合酶相似，只是外切核酸酶活性更强，在诱变反应中很有用。T7噬菌体DNA聚合酶与T4DNA聚合酶活性类似，是所有DNA聚合酶中持续合成能力最强的一种，可用于长模板的引物延伸。耐热DNA聚合酶：如TaqDNA聚合酶
5、、VentDNA聚合酶、PfuDNA聚合酶等，来自嗜高温细菌，主要用于PCR反应。（5）T4多核百酸激酶（PNK）：—种磷酸化酶，可将ATP的Y-磷酸基团转移至DNA或RNA的5’末端。该酶主要用于对缺乏磷酸的DNA或合成接头进行磷酸化（消耗ATP）,同时可对末端进行标记（先去磷酸化ADP-ATP,再磷酸化ATP—ADP）O（6）碱性磷酸酶（如小牛肠碱性磷酸酶，CIP）：该酶催化去除DNA或RNA的弘磷酸，防止DNA片段的自身连接。用该酶后要进行纯化，避免残留。（7）末端脱氧核昔酸转移酶：源于小牛胸腺的
6、一种不寻常DNA聚合酶，可不依赖于模板。在2价阳离子存在下,该酶催化dNTP加于DNA分子的3学仝基端。若dNTP为T或C,阳离子首选C<>2+；若dNTP为A或G,阳离子首选MS2+o该酶可在eDNA或载体3,末端加同聚尾，便于克隆；也可用标记的rNTP>ddNTP或ddNTP来标记DNA片段的3,末端。（8）反转录酶即依赖于RNA的DNA聚合酶：有◎孑合成DNA活性，但是无-►3，5,外切核酸酶活性，该酶主要用来eDNA克隆中第一链的合成、测定mRNA转录起始点、5,突出DNA的补平和标记、双脱氧终
7、止法测序、RT-PCR等。该酶有两种来源：AMV（禽成髄细胞瘤病毒）反转录酵！具亍孑合成DNA活性和RNaseH活性；Mo-MLV（鼠白血病病毒）反转录酶。（9）依赖于DNA的RNA聚合酶（Sp6、T7和T4噬菌体RNA聚合酶）：该酶为转录中的RNA合成酶，识别DNA中各自特异的启动子序列，无需引物。用于单链RNA探针；合成mRNA用于体外蛋白质合成。(10)核酸酶：①Bal31核酸酶：主要活性为3,外切核酸酶活性(Ca2j,可从线性DNA两条链的3,端去除掉单核哥酸，达到两头缩短DNA的目的，用于缺失
8、突变，构建嵌套缺失体；也可用来制作DNA限制酶切图；确定DNA二级结构和从单链RNA±去除核昔酸。②S1核酸酶：可降解单链DNA或RNA,是一种单链核酸酶。产生带5-磷酸的单核首酸或寡核苛酸双链，可用于分析DNA:RNA杂交体的结构，去掉突出的单链尾以产生平末端；降解发夹结构。③绿豆核酸酶：与S1核酸酶相似，但更温和。④脫氧核糖核酸酶1:可优先从陀旋核哥酸的位置水解dsDNA或ssDNA。可在切口平移标记时在dsDNA±随机产生切口；在闭环
