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时间:2018-11-30
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1、盐酸小檗碱对大鼠主动脉内皮细胞增殖与凋亡的作用[摘要]目的观察盐酸小檗碱对大鼠主动脉内皮细胞增殖与凋亡的作用,以探讨盐酸小檗碱促进内皮细胞凋亡的机制。方法25umol/L、50umol/L、75umol/L、100umol/L浓度小檗碱分别干预大鼠主动脉内皮细胞1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h、72h。MTr法检测细胞增殖活性,I.1640培养基:Gibico公司;噻唑兰(MrlT):凯基生物试剂公司;胎牛血清:Hyclone公司;BAX:SANTA公司;beta-actin:ABJENT;HRP标记的羊抗兔抗体BCA试剂盒、RIPA裂解液、
2、PMSF、PVDF膜:碧云天公司;二甲基亚砜(DMSO):Sigma公司;全自动酶标仪MuhiskanMK3:Thermo公司;电泳槽、电泳仪、凝胶成像仪:BIO-RAD。 1.2实验方法 1.2.1大鼠主动脉内皮细胞的复苏、培养将冻存于液氮的大鼠主动脉内皮细胞解冻、1000转/分离心3min,并在含10%胎牛血清的PRMI-1640培养基中培养,置于37℃、5%CO2培养箱。当细胞长到80%左右,用0.25%胰酶(含EDTA)消化传代。在显微镜下观察细胞状态、形态,选取状态优良的细胞进行后续体外试验。 1.2.2MTT法检测盐酸小檗碱对大鼠主动脉内
3、皮细胞增殖的影响对消化的大鼠主动脉内皮细胞进行细胞计数,以1×104细胞/孔加入96孔板中,每孔200uL,置于37℃、5%CO2培养箱中培养24h。待细胞贴壁后加人不同浓度的盐酸小檗碱(0umol/L、25umol//L,50umol//L、75umol//L、100umol//L),每组6个复孔,培养1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h、72h。培养结束弃上清,避光加人M1Tr溶液(终浓度5mg/m1),置于37℃、5%CO2培养箱继续培养4h,弃细胞上清液,每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150uL,于恒温振荡箱反应10min以充分溶解。在全
4、自动酶标仪490nm处测吸光度OD值。 1.2.3SF混合液提取各组细胞总蛋白,注意冰上操作,以减轻蛋白裂解;使用BCA试剂盒测定蛋白浓度,酶标仪562nm处检测OD值,计算出蛋白的质量。每个样品加5xSDS25uL,100℃沸水中变性。分别从每组中取总蛋白25ug制备蛋白上样,进行12%SDS-PAGE胶电泳,连接正负极,加满电泳液,开始使用80V电压.跑30min后把电压改为120V.样本继续跑1h,直到溴酚蓝跑出玻璃板。PVDF膜转膜,电泳槽置冰上,100V电压跑75min。丽春红染色并用去离子水清洗,配一抗、二抗稀释液(水:casein=20:1
5、),抗体浓度为(1:1000),一抗4℃过夜,TBST洗膜3次,每次7min,二抗室温孵育2h,TBST洗膜3次,每次7min,用碧云天ECL发光液进行发光,通过凝胶成像仪显影,并用imageJ进行灰度值分析。 1.3�y计学方法应用SPSS13.0统计软件进行分析,计量资料采用均数±标准差(x±s)表示,多个样本均数比较采用成组设计的单因素方差分析,3个样本均数两两比较的q检验(Nean-Keuls法),检验水准:a=0.05,双侧检验。 2.结果 2.1不同浓度小檗碱在不同干预时间作用下的OD值使用25umol//L、50umol/L、75umo
6、l/L、100umol/L浓度小檗碱分别干预大鼠主动脉内皮细胞1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h、72h。MTY法检测细胞增殖活性结果。由表1、图1可见,与对照组(0umol/L)相比,25umol//L、50umol/L、75umol/L、100umol/L浓度小檗碱作用8h、12h、24h、48h、72h时差异均有统计学意义(P<0.01),提示小檗碱对大鼠主动脉内皮细胞具有抑制增殖活性的作用。不同浓度作用12h、24hOD值变化较明显,且这两个时间点效果相似,故选取12h作为最适作用时间。其中各浓度作用1h、2h,内皮细胞抑制率低于10%
7、;4h、8h内皮细胞抑制率低于25%;12h、24h、48h、72h内皮细胞抑制率为31%-62%,其中72小时100umol/L小檗碱作用内皮细胞抑制率可达到62%。 2.2不同浓度盐酸小檗碱处理后BAX蛋白表达水平不同浓度盐酸小檗碱处理大鼠主动脉内皮细胞24h后,ol/L、50umol//L、75umol/L、100umol/L浓度小檗碱促进促凋亡蛋白BAX水平的表达.但是未见浓度依赖性。
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