盐酸小檗碱对大鼠主动脉内皮细胞增殖与凋亡的作用

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1、盐酸小檗碱对大鼠主动脉内皮细胞增殖与凋亡的作用[摘要]目的观察盐酸小檗碱对大鼠主动脉内皮细胞增殖与凋亡的作用，以探讨盐酸小檗碱促进内皮细胞凋亡的机制。方法25umol/L、50umol/L、75umol/L、100umol/L浓度小檗碱分别干预大鼠主动脉内皮细胞1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h、72h。MTr法检测细胞增殖活性，I.1640培养基：Gibico公司；噻唑兰（MrlT）：凯基生物试剂公司；胎牛血清：Hyclone公司；BAX：SANTA公司；beta-actin：ABJENT；HRP标记的羊抗兔抗体BCA试剂盒、RIPA裂解液、

2、PMSF、PVDF膜：碧云天公司；二甲基亚砜（DMSO）：Sigma公司；全自动酶标仪MuhiskanMK3：Thermo公司；电泳槽、电泳仪、凝胶成像仪：BIO-RAD。　　1.2实验方法　　1.2.1大鼠主动脉内皮细胞的复苏、培养将冻存于液氮的大鼠主动脉内皮细胞解冻、1000转/分离心3min，并在含10%胎牛血清的PRMI-1640培养基中培养，置于37℃、5%CO2培养箱。当细胞长到80%左右，用0.25%胰酶（含EDTA）消化传代。在显微镜下观察细胞状态、形态，选取状态优良的细胞进行后续体外试验。　　1.2.2MTT法检测盐酸小檗碱对大鼠主动脉内

3、皮细胞增殖的影响对消化的大鼠主动脉内皮细胞进行细胞计数，以1×104细胞/孔加入96孔板中，每孔200uL，置于37℃、5%CO2培养箱中培养24h。待细胞贴壁后加人不同浓度的盐酸小檗碱（0umol/L、25umol//L，50umol//L、75umol//L、100umol//L），每组6个复孔，培养1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h、72h。培养结束弃上清，避光加人M1Tr溶液（终浓度5mg/m1），置于37℃、5%CO2培养箱继续培养4h，弃细胞上清液，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）150uL，于恒温振荡箱反应10min以充分溶解。在全

4、自动酶标仪490nm处测吸光度OD值。　　1.2.3SF混合液提取各组细胞总蛋白，注意冰上操作，以减轻蛋白裂解；使用BCA试剂盒测定蛋白浓度，酶标仪562nm处检测OD值，计算出蛋白的质量。每个样品加5xSDS25uL，100℃沸水中变性。分别从每组中取总蛋白25ug制备蛋白上样，进行12%SDS-PAGE胶电泳，连接正负极，加满电泳液，开始使用80V电压.跑30min后把电压改为120V.样本继续跑1h，直到溴酚蓝跑出玻璃板。PVDF膜转膜，电泳槽置冰上，100V电压跑75min。丽春红染色并用去离子水清洗，配一抗、二抗稀释液（水：casein=20：1

5、），抗体浓度为（1：1000），一抗4℃过夜，TBST洗膜3次，每次7min，二抗室温孵育2h，TBST洗膜3次，每次7min，用碧云天ECL发光液进行发光，通过凝胶成像仪显影，并用imageJ进行灰度值分析。　　1.3�y计学方法应用SPSS13.0统计软件进行分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，多个样本均数比较采用成组设计的单因素方差分析，3个样本均数两两比较的q检验（Nean-Keuls法），检验水准：a=0.05，双侧检验。　　2.结果　　2.1不同浓度小檗碱在不同干预时间作用下的OD值使用25umol//L、50umol/L、75umo

6、l/L、100umol/L浓度小檗碱分别干预大鼠主动脉内皮细胞1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h、72h。MTY法检测细胞增殖活性结果。由表1、图1可见，与对照组（0umol/L）相比，25umol//L、50umol/L、75umol/L、100umol/L浓度小檗碱作用8h、12h、24h、48h、72h时差异均有统计学意义（P<0.01），提示小檗碱对大鼠主动脉内皮细胞具有抑制增殖活性的作用。不同浓度作用12h、24hOD值变化较明显，且这两个时间点效果相似，故选取12h作为最适作用时间。其中各浓度作用1h、2h，内皮细胞抑制率低于10%

7、；4h、8h内皮细胞抑制率低于25%；12h、24h、48h、72h内皮细胞抑制率为31%-62%，其中72小时100umol/L小檗碱作用内皮细胞抑制率可达到62%。　　2.2不同浓度盐酸小檗碱处理后BAX蛋白表达水平不同浓度盐酸小檗碱处理大鼠主动脉内皮细胞24h后，ol/L、50umol//L、75umol/L、100umol/L浓度小檗碱促进促凋亡蛋白BAX水平的表达.但是未见浓度依赖性。