维拉帕米诱导人视网膜色素上皮细胞凋亡及细胞内钙变化论文

《维拉帕米诱导人视网膜色素上皮细胞凋亡及细胞内钙变化论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、维拉帕米诱导人视网膜色素上皮细胞凋亡及细胞内钙变化论文【摘要】目的：探讨钙通道拮抗剂—维拉帕米（verapamil，Ver）对体外培养的人视网膜色素上皮（humanretinalpigmentepithelium,hRPE）细胞凋亡诱导作用及凋亡过程中细胞内钙浓度Ca2+i的变化。方法：应用80mg/L的Ver作用体外培养hRPE细胞12，24及48h，采用吖叮橙（AO）荧光染色法、透射电镜、流式细胞术观察hRPE细胞凋亡；Fluo-3/AM负载技术，观察凋亡过程中细胞Ca2+i的变化。结果：一定浓度Ver可诱导hRPE细胞凋亡，荧光显微镜及电镜观察hRPE细胞具有早期凋亡特征：核荧光呈

2、黄绿色，电镜下核染色质浓染、边集。流式细胞术显示，Ver作用后的hRPE细胞凋亡百分率增加（F＝12.3415.freelil，Ver）、二甲基亚砜（DMSO）、吖叮橙（AO）、A23187均为美国Sigma公司产品；Fluo-3/AM荧光探针（EugeneOregon,USA）；其它试剂均为国产分析纯。采用胰蛋白酶消化法5。在无菌状态下，取角膜移植后的供体眼球（供体年龄限制24～38岁），在无菌PBS液中沿角巩膜缘后2mm处环形剪开，弃去眼前节及玻璃体，自视盘处分离视网膜神经上皮层，加入2.5g/L胰酶消化混合液，于37℃消化1h，加入含200mL/L新生牛血清DMEM的培养液，用吸管

3、吹打RPE细胞面使细胞脱落，将含RPE细胞的液体移入离心管中，离心1000r/min×8min，弃上清后，加入培养液，调整细胞密度1×105/L，将RPE细胞悬液接种于6孔板内，37℃，50mL/LCO2孵箱中培养。RPE传代培养同文献6，3～6代细胞用于本实验。1.2方法将第3代的hRPE细胞种植于内置盖玻片的24孔板中，加入Ver80mg/L，作用12，24，48h后，取出玻片，与未加药的对照组，投入950mL/L乙醇中固定30min，微干，10mL/L醋酸作用30s，1×10-4吖啶橙（AO）染色1min，0.1mol/L氯化钙处理2min。PBS漂洗3次。且用PBS封片，荧光显微

4、镜下直接观察，每孔重复3次。在4℃条件下离心，收集80mg/LVer作用12，24，48h后及未加药的hRPE细胞5×106个/L，加入等量25g/L戊二醛固定，离心5min，弃去上清，移至离心管中，加入25g/L戊二醛固定，4℃作用30min。常规电镜固定包埋，柠檬酸铅染色，透射电镜上观察，摄片。以80mg/L浓度的Ver，作用12，24，48h后，收集2×106/L个细胞，离心1000r/min×5min，PBS漂洗1次。离心去PBS，加入PI染液0.5mL，4℃避光作用30min。荧光染色剂PI用氩离子激发荧光，激光发光波长488nm，流式细胞仪采集数据，cellquest分析软件

5、分析，通过计算凋亡区（亚二倍体区）细胞数量得出凋亡率。每个样本重复3次。将1×105/L细胞接种于3.5cm2的一次性培养皿中，待细胞80%融合后，加入终浓度80mg/L的Ver，作用12，24，48h，换液后，加入无血清DMEM液体1mL，加入终浓度10μmol/LFLUO-3/AM染色，37℃，50mL/LCO2孵箱内孵育45min，PBS充分洗去染料，室温静置15min后，置于MetaFluo4.5/coolsnapfx/IX70细胞内钙离子荧光成像测定系统操作台上，25℃测定单个细胞钙荧光强度，激发波长488nm，40倍物镜观察，每组计算20个单个细胞钙离子浓度，取其均值。加入A

6、231875μmol测定最高荧光强度值，加入0.2mmolMnCl2测定最低荧光强度值，细胞内钙浓度按Ca2+i＝Kd（Fmax-F）/（F-Fmin）公式计算，Kd＝400，Fmax为最强荧光值，Fmin为最低荧光值，F为测得细胞荧光值。统计学处理：采用方差分析进行统计学检验，统计过程均用SPSS10.0软件进行，数据用x±s表示。2结果2.1AO染色结果在荧光显微镜下，未加药组AO染色的HRPE细胞呈梭形，细胞质呈红色荧光，细胞核呈绿色均匀荧光，可见深染细胞核核仁（图1）。经80mg/LVer作用后，可见凋亡细胞呈圆形，体积明显缩小，细胞核内可见致密浓染的黄色荧光（图2）。Ver作用

7、48h后的凋亡细胞数量比24h的明显增多，贴壁细胞明显减少。而作用12h的细胞与未加药组细胞比较无明显变化。图1正常hRPE细胞呈梭形，细胞质呈红色荧光，细胞核呈绿色均匀荧光，可见深染细胞核核仁AO×200图2Ver作用hRPE细胞48h，细胞呈圆形，体积明显缩小，细胞核内可见致密浓染的黄色荧光AO×2002.2透射电镜结果正常hRPE细胞超微结构见细胞核膜完整，染色质均匀分布。Ver作用12h后，细胞超微结构与未加药组无明显差异。