维拉帕米诱导人视网膜色素上皮细胞凋亡及细胞内钙变

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1、维拉帕米诱导人视网膜色素上皮细胞凋亡及细胞内钙变【摘要】目的：探讨钙通道拮抗剂—维拉帕米（verapamil，Ver）对体外培养的人视网膜色素上皮（humanretinalpigmentepithelium,hRPE）细胞凋亡诱导作用及凋亡过程中细胞内钙浓度[Ca2+]i的变化。方法：应用80mg/L的Ver作用体外培养hRPE细胞12，24及48h，采用吖叮橙（AO）荧光染色法、透射电镜、流式细胞术观察hRPE细胞凋亡；Fluo-3/AM负载技术，观察凋亡过程中细胞[Ca2+]i的变化。结果：一定浓度

2、Ver可诱导hRPE细胞凋亡，荧光显微镜及电镜观察hRPE细胞具有早期凋亡特征：核荧光呈黄绿色，电镜下核染色质浓染、边集。流式细胞术显示，Ver作用后的hRPE细胞凋亡百分率增加（F＝12.3415，P＜0.05）。Ver作用的hRPE细胞内钙浓度（[Ca2+]i）呈下降趋势（F＝23.607，P＜0.01）。结论：Ver能诱导体外培养的hRPE细胞凋亡，细胞内[Ca2+]i浓度的变化可能是诱导hRPE凋亡的机制之一。【关键词】视网膜色素上皮细胞0引言增殖性玻璃体视网膜病变（proliferativev

3、itreoretinopathy，PVR）是孔源性视网膜脱离的常见并发症和手术失败的主要原因，尽管玻璃体视网膜手术技术不断提高，但复发率并未改善[1]，同时玻璃体切割手术本身就是诱导PVR形成的一个危险因素[2]。RPE细胞的迁移、增殖可启动PVR的形成，而细胞内Ca2+的升高是RPE细胞增殖的危险因素[3]。Ver是一种可靠的慢钙通道阻滞剂，能阻止细胞外钙内流，在PVR发生中对RPE细胞增殖起着重要调节作用[4]。本研究应用一定浓度钙通道阻断剂Ver，作用于体外培养hRPE细胞，诱导其凋亡并观察凋亡过

4、程中细胞内[Ca2+]i的变化。1材料和方法1.1材料流式细胞仪（B.D公司），DIAGNOSTICINSTRUMENTS-SPOTINSIGH荧光摄像（USA）系统及MetaFluo4.5/coolsnapfx/IX70细胞内钙离子荧光成像（USA）测定系统。DMEM培养基(Gibco)、新生牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)、胰蛋白酶(1∶250Difco，Gibco)、维拉帕米（verapamil，Ver）、二甲基亚砜（DMSO）、吖叮橙（AO）、A23187均为美国Sigma公司产品；Flu

5、o-3/AM荧光探针（EugeneOregon,USA）；其它试剂均为国产分析纯。采用胰蛋白酶消化法[5]。在无菌状态下，取角膜移植后的供体眼球（供体年龄限制24～38岁），在无菌PBS液中沿角巩膜缘后2mm处环形剪开，弃去眼前节及玻璃体，自视盘处分离视网膜神经上皮层，加入2.5g/L胰酶消化混合液，于37℃消化1h，加入含200mL/L新生牛血清DMEM的培养液，用吸管吹打RPE细胞面使细胞脱落，将含RPE细胞的液体移入离心管中，离心1000r/min×8min，弃上清后，加入培养液，调整细胞密度1×

6、105/L，将RPE细胞悬液接种于6孔板内，37℃，50mL/LCO2孵箱中培养。RPE传代培养同文献[6]，3～6代细胞用于本实验。1.2方法将第3代的hRPE细胞种植于内置盖玻片的24孔板中，加入Ver80mg/L，作用12，24，48h后，取出玻片，与未加药的对照组，投入950mL/L乙醇中固定30min，微干，10mL/L醋酸作用30s，1×10-4吖啶橙（AO）染色1min，0.1mol/L氯化钙处理2min。PBS漂洗3次。且用PBS封片，荧光显微镜下直接观察，每孔重复3次。在4℃条件下离心

7、，收集80mg/LVer作用12，24，48h后及未加药的hRPE细胞5×106个/L，加入等量25g/L戊二醛固定，离心5min，弃去上清，移至离心管中，加入25g/L戊二醛固定，4℃作用30min。常规电镜固定包埋，柠檬酸铅染色，透射电镜上观察，摄片。以80mg/L浓度的Ver，作用12，24，48h后，收集2×106/L个细胞，离心1000r/min×5min，PBS漂洗1次。离心去PBS，加入PI染液0.5mL，4℃避光作用30min。荧光染色剂PI用氩离子激发荧光，激光发光波长488nm，流式

8、细胞仪采集数据，cellquest分析软件分析，通过计算凋亡区（亚二倍体区）细胞数量得出凋亡率。每个样本重复3次。将1×105/L细胞接种于3.5cm2的一次性培养皿中，待细胞80%融合后，加入终浓度80mg/L的Ver，作用12，24，48h，换液后，加入无血清DMEM液体1mL，加入终浓度10μmol/LFLUO-3/AM染色，37℃，50mL/LCO2孵箱内孵育45min，PBS充分洗去染料，室温静置15min后，置于MetaFluo