bFGF诱导人胚视网膜色素上皮细胞转分化

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1、复旦大学硕士学位论文中文摘要bFGF诱导人胚眼视网膜色素上皮细胞转分化中文摘要胚胎发育过程中，视杯内层分化形成神经视网膜上皮层，而外层分化为视网膜色素上皮(褂)E)层。RPE由一层连续排列的六棱柱形细胞组成，相邻的RPE细胞间有连接复合体，底部胞膜向胞体内陷入形成底部内褶。RPE细胞多为单核，内有多种丰富的细胞器及色素颗粒。RPE具有转运功能、屏障作用、吞噬活性和遮光吸热特点，在维持神经视网膜正常功能和保证眼的视觉功能方面起重要作用。各种先天性视网膜疾病的发病机制以及神经视网膜损伤后的再生修复均与视网膜的胚胎发育发生有着密切关系。RPE在胚胎时期的正常发育对神经视网膜层的分化、

2、形成和生长发育等方面具有重要作用。胚胎和成体RPE细胞的分化状态都具有不稳定性。在成体的正常状况下，RPE细胞处于静息状态，无增殖能力；但在诸多环境因素的改变下，可使静息状态的RPE细胞变成有活力的细胞，而引起细胞的迁移和增殖。如光凝或物理损伤刺激时，体内RPE细胞分裂增殖，是引起人类增殖性玻璃体视网膜病的重要原因。动物实验表明视网膜脱离可以导致RPE细胞骨架改变，甚至形成复层上皮结构。通过两栖类动物和鸡胚神经视网膜损伤后的再生研究表明，RPE细胞可向神经视网膜前体细胞转分化来实现神经视网膜再生i其中控制RPE细胞和神经视网膜细胞分化发育的因素包括FGF家族及细胞外基质成分。神

3、经视网膜上皮细胞作为终末分化的细胞，损伤后不能再生，常导致许多致盲性疾病：探索人类RPE细胞转分化为神经视网膜细胞具有重大意义。目前，国内外关于人类RPE细胞转分化尚未见报道。本实验以早期人胚ROE细胞为对象，研究bFGF诱导人胚RPE细胞转分化。目的：观察体外培养早期人胚RPE细胞的生物学特性；探讨bFGF体外诱导RPE细胞转分化现象及其分子机制。为视网膜发育的进一步基础研究和临床RPE细胞移植奠定基础。方法：取人工流产4h以内人胚(6w--10w)眼球，通过混合酶消化法获取RPE细胞。用F12培养液体外培养并作细胞形态学、S-100和Keratin免疫组织复旦大学硕士学位论

4、文中文摘要化学鉴定。bFGF(20ng／m1)诱导培养(4d—_6d)后观察RPE细胞形态学的改变，用免疫细胞化学作转分化RPE细胞鉴定。通过Trizol一步法提取总RNA，逆转录聚合酶反应(RT-PCR)分析体外培养RPE细胞酪氨酸酶基因及bFGF诱导培养转分化后RPE细胞小眼畸形基因(MITF)的表达。结果：用F12培养液体外培养可获得纯化、活性好的人胚RPE细胞；体外培养的RPE细胞不表达酪氨酸酶基因。bFGF诱导培养的人胚RPE细胞发生明显的表型改变，出现具有长突起的神经样细胞：不仅仍表达自身上皮细胞标记物角蛋白(Keratin)，同时还表达多种神经视网膜上皮细胞标记物

5、(MAP2、GS、GFAP、Peripherin、Opsin，但不表达NCAM)；用RT-PCR方法没有检测到转分化RPE细胞MITF．AmRNA表达：而bFGF对成人RPE细胞无此作用。结论：早期人胚RPE细胞具有在体RPE细胞的部分特征，并具有一定的可塑性，甚至具有某些千细胞的特征；bFGF可以诱导早期人胚RPE细胞表达多种神经视网膜上皮细胞标记物，可能是通过抑制MITF-A的分子信号通路。通过本实验的初步研究表明，早期人胚RPE细胞发育有一定的可塑性，甚至具有干细胞的部分特征。神经视网膜损伤后不能再生，探讨合适的诱导因素使RPE细胞定向转分化为某一类神经视网膜细胞，则需要

6、进一步深入研究，同时也具有更重大的意义。关键词：人胚视网膜色素上皮转分化神经视网膜上皮酪氨酸酶小眼畸形基因2墨里查堂堡主堂垡兰苎苎奎塑要bFGFInducedTransdifferentiationofHumanEmbryonicRetinalPigmentEpitheliumCellsABSTRACTDuringembryogenesis，theopticvesiclegrowsoutfromtheventrolateralforebrainneuroepithelium．Theopticvesicle，inacomplexseriesofinteractionswithth

7、edevelopinglensvesicle，invaginatestOformtheopticcup．Theinnerandouterlayersoftheopticcupgiverivetoneuralretinaandretinalpigmentepithelium(RPE)respectively．ThematureRPEisamosaicofpolygonalcellsinterposedbetweenthechoroidandtheneuralretina．Theapicalsi