猪光感受器外节诱导人视网膜色素上皮细胞脂褐素形成

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1、猪光感受器外节诱导人视网膜色素上皮细胞脂褐素形成作者：牛超，惠延年，王雨生，张鹏【摘要】建立体外培养的人视网膜色素上皮(RPE)细胞脂褐素形成模型,为研究RPE细胞衰老过程中细胞结构及功能的改变以及由于其衰老而引起的一系列年龄相关性眼病如年龄相关性黄斑变性奠定基础。方法：采用梯度离心法制备猪眼光感受器外节(POS)，将实验组RPE细胞与POS共培养3L/L酒精浸泡消毒5min，无菌处理后将眼球角膜向上置于眼球托上，自赤道部环形剪开眼球壁，体视显微镜下小心将视网膜分离取出，移入D-Hanks溶液配制的2.5g/L胰蛋白酶(美国Sigma公司)中。

2、将视网膜组织在冰上进行消化并用磁力搅拌器搅拌15min。将消化后的溶液移入干净的试管中0℃静置10min，待大块的视网膜组织沉淀后取上清液以3000r/min离心10min。离心后的沉淀用D-Hanks溶液漂洗并再次离心，反复操作2次，将收集到的POS计数并分散于100mL/L胎牛血清DMEM/F12培养液(Gibco公司)，调整为2×1010个/L，用光镜、透射电镜观察进行鉴定。1.2方法采用胰蛋白酶消化法[5]体外培养的第2代人RPE细胞，以5×104个/L的密度接种于25mL培养瓶中，放在37℃，50mL/LCO2孵箱静置培养，次日更换培

3、养液，以后隔天更换培养液，待细胞接近铺满时按1∶2进行传代并随机分为实验组和对照组。实验组细胞用含有POS的培养液培养3in，5min×2次。弃去培养液，PBS溶液漂洗细胞3次，缓慢加入35g/L戊二醛，4℃过夜。送至电镜室，常规脱水，浸透，包埋，切片，染色，透射电镜观察和照相。2结果2.1POS的鉴定倒置显微镜下观察，制备好的POS大小均一，形态类似，呈棒状均匀分布于培养液，其中散在少量细胞及杂质(图1A,B)。电子显微镜下观察，POS由胞质膜向内折叠构成了双层膜盘结构，除了与外节长轴相垂直的膜盘排列外，还可见到与外节长轴平行的膜盘以及斜形排

4、列的膜盘(图2)。A:×100;B:×400图1倒置相差显微镜下制备的POS图2电子显微镜下制备的POS×250002.2RPE细胞脂褐素透射电镜下观察对照组RPE的各细胞器清晰，游离核糖体丰富,分布均匀，粗面内质网排列规则，线粒体膜和嵴完整，高尔基体形态规整，核内染色质均匀。培养3.图3对照组RPE细胞可见少量脂褐素小体（箭头）TEM×10000A:POS膜盘处于RPE细胞之间，尚未被吞噬TEM×10000；B:POS膜盘与RPE细胞接触，RPE胞膜表面内陷，将要吞噬膜盘TEM×15000；C:细胞内出现大量高电子密度的均质小体和溶酶体TEM

5、×7500；D:胞质内尚未消化完全的POS膜盘结构TEM×15000图4吞噬制备的POS的RPE细胞脂褐素形成TEM3讨论正常人原代细胞经体外培养数代后最终都失去增殖活力，逐渐衰老死亡[6]。细胞衰老机制一直是人们研究的热点。脂褐素是一种脂质或蛋白质的聚合物，存在于不同组织有丝分裂后细胞的溶酶体内,它是溶酶体对细胞内结构或功能不健全的亚细胞成分进行自体吞噬后形成的残余物质，并随着年龄的增加而增多，因此又被称为“衰老色素”或“衰老标志”，它是整个细胞功能下降的一种生物学指标。对于RPE来说，脂褐素的形成则是由于RPE不断吞噬POS末端不断脱落的膜

6、盘造成的。脂褐素作为被吞噬膜盘的不完全降解物堆积在RPE内，长期的堆积将严重影响细胞的功能，造成RPE的衰老及凋亡，进而引起一系列年龄相关性眼病如AMD的发生。据统计，一个80岁老人RPE中脂褐素的体积最终会占到胞质容积的19％[7]。因此，如果能在实验条件下使细胞内堆积脂褐素，找到一些重复性强的实验途径，成功的在年轻个体中形成脂褐素，甚至使细胞的寿命有所改变，那就会在解决脂褐素同衰老过程的关系问题上获得更多的线索。我们对培养的RPE内脂褐素的含量变化进行了观察，以脂褐素含量的增多作为细胞衰老的指标。我们将预先制备好的猪眼POS与人RPE共培养

7、，用电镜记录细胞内脂褐素形成的过程。通过电子显微镜观察，Nunomura等[8]将脂褐素分为3型：I型由电子密度稍高的细微颗粒组成，可能含有空泡，即空泡小体；II型为均质无构造的团块，即均质小体；III型为板层结构，即板层小体。HEinsen[9]描述小脑脂褐素由3种成分组成：①小滴状均一的电子透明区；②颗粒状基质；③强嗜哦性小区。这三部分所占比例因细胞类型而异。在本实验中，对照组RPE培养3anA,BrunkUT.Lipofuscin.IntJBiochemCellBiol,2004;36:1400-14042BoultonM,Dayhaen

8、tepithelium:topographicalvariationandagEIngchanges.Eye,2001;15:384-3893韩泉洪,