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1、猪光感受器外节诱导人视网膜色素上皮细胞脂褐素形成论文牛超，惠延年，王雨生，张鹏【摘要】建立体外培养的人视网膜色素上皮(RPE)细胞脂褐素形成模型,为研究RPE细胞衰老过程中细胞结构及功能的改变以及由于其衰老而引起的一系列年龄相关性眼病如年龄相关性黄斑变性奠定基础。方法：采用梯度离心法制备猪眼光感受器外节(POS)，将实验组RPE细胞与POS共培养3L/L酒精浸泡消毒5min，无菌处理后将眼球角膜向上置于眼球托上，自赤道部环形剪开眼球壁，体视显微镜下小心将视网膜分离取出，移入D-Hanks溶液配制的2.5g/L胰蛋白酶(美国
2、Sigma公司)中。将视网膜组织在冰上进行消化并用磁力搅拌器搅拌15min。将消化后的溶液移入干净的试管中0℃静置10min，待大块的视网膜组织沉淀后取上清液以3000r/min离心10min。离心后的沉淀用D-Hanks溶液漂洗并再次离心，反复操作2次，将收集到的POS计数并分散于100mL/L胎牛血清DMEM/F12培养液(Gibco公司)，调整为2×1010个/L，用光镜、透射电镜观察进行鉴定。1.2方法采用胰蛋白酶消化法5体外培养的第2代人RPE细胞，以5×104个/L的密度接种于25mL培养瓶中，放在37℃，50
3、mL/LCO2孵箱静置培养，次日更换培养液，以后隔天更换培养液，待细胞接近铺满时按1∶2进行传代并随机分为实验组和对照组。实验组细胞用含有POS的培养液培养3in，5min×2次。弃去培养液，PBS溶液漂洗细胞3次，缓慢加入35g/L戊二醛，4℃过夜。送至电镜室，常规脱水，浸透，包埋，切片，染色，透射电镜观察和照相。2结果2.1POS的鉴定倒置显微镜下观察，制备好的POS大小均一，形态类似，呈棒状均匀分布于培养液，其中散在少量细胞及杂质(图1A,B)。电子显微镜下观察，POS由胞质膜向内折叠构成了双层膜盘结构，除了与外节长
4、轴相垂直的膜盘排列外，还可见到与外节长轴平行的膜盘以及斜形排列的膜盘(图2)。A:×100;B:×400图1倒置相差显微镜下制备的POS图2电子显微镜下制备的POS×250002.2RPE细胞脂褐素透射电镜下观察对照组RPE的各细胞器清晰，游离核糖体丰富,分布均匀，粗面内质网排列规则，线粒体膜和嵴完整，高尔基体形态规整，核内染色质均匀。培养3ura等8将脂褐素分为3型：I型由电子密度稍高的细微颗粒组成，可能含有空泡，即空泡小体；II型为均质无构造的团块，即均质小体；III型为板层结构，即板层小体。Heinsen9描述小脑脂
5、褐素由3种成分组成：①小滴状均一的电子透明区；②颗粒状基质；③强嗜哦性小区。这三部分所占比例因细胞类型而异。在本实验中，对照组RPE培养3anA,BrunkUT.Lipofuscin.IntJBiochemCellBiol,2004;36:1400-14042BoultonM,Dayhaentepithelium:topographicalvariationandageingchanges.Eye,2001;15:384-3893韩泉洪,贾洪真,郭长梅,.freelentsbyculturedpigmentepitheli
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