维拉帕米诱导人视网膜色素上皮细胞凋亡及细胞内钙变化

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1、维拉帕米诱导人视网膜色素上皮细胞凋亡及细胞内钙变化【摘要】目的：探讨钙通道拮抗剂—维拉帕米（verapamil，Ver）对体外培养的人视网膜色素上皮（humanretinalpigmentepithelium,hRPE）细胞凋亡诱导作用及凋亡过程中细胞内钙浓度[Ca2+]i的变化。方法：应用80mg/L的Ver作用体外培养hRPE细胞12，24及48h，采用吖叮橙（AO）荧光染色法、透射电镜、流式细胞术观察hRPE细胞凋亡；Fluo-3/AM负载技术，观察凋亡过程中细胞[Ca2+]i的变化。结果：一定浓度Ver可诱导hRPE细胞凋亡，荧光显微镜及电镜观察hRPE细

2、胞具有早期凋亡特征：核荧光呈黄绿色，电镜下核染色质浓染、边集。流式细胞术显示，Ver作用后的hRPE细胞凋亡百分率增加（F＝12.3415，P＜0.05）。Ver作用的hRPE细胞内钙浓度（[Ca2+]i）呈下降趋势（F＝23.607，P＜0.01）。结论：Ver能诱导体外培养的hRPE细胞凋亡，细胞内[Ca2+]i浓度的变化可能是诱导hRPE凋亡的机制之一。【关键词】视网膜色素上皮细胞0引言增殖性玻璃体视网膜病变（proliferativevitreoretinopathy，PVR）是孔源性视网膜脱离的常见并发症和手术失败的主要原因，尽管玻璃体视网膜手术技术不断

3、提高，但复发率并未改善[1]，同时玻璃体切割手术本身就是诱导PVR形成的一个危险因素[2]。RPE细胞的迁移、增殖可启动PVR的形成，而细胞内Ca2+的升高是RPE细胞增殖的危险因素[3]。Ver是一种可靠的慢钙通道阻滞剂，能阻止细胞外钙内流，在PVR发生中对RPE细胞增殖起着重要调节作用[4]。本研究应用一定浓度钙通道阻断剂Ver，作用于体外培养hRPE细胞，诱导其凋亡并观察凋亡过程中细胞内[Ca2+]i的变化。1材料和方法1.1材料流式细胞仪（B.D公司），DIAGNOSTICINSTRUMENTS-SPOTINSIGH荧光摄像（USA）系统及MetaFluo

4、4.5/coolsnapfx/IX70细胞内钙离子荧光成像（USA）测定系统。DMEM培养基(Gibco)、新生牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)、胰蛋白酶(1∶250Difco，Gibco)、维拉帕米（verapamil，Ver）、二甲基亚砜（DMSO）、吖叮橙（AO）、A23187均为美国Sigma公司产品；Fluo-3/AM荧光探针（EugeneOregon,USA）；其它试剂均为国产分析纯。采用胰蛋白酶消化法[5]。在无菌状态下，取角膜移植后的供体眼球（供体年龄限制24～38岁），在无菌PBS液中沿角巩膜缘后2mm处环形剪开，弃去眼前节及玻璃体，自视盘

5、处分离视网膜神经上皮层，加入2.5g/L胰酶消化混合液，于37℃消化1h，加入含200mL/L新生牛血清DMEM的培养液，用吸管吹打RPE细胞面使细胞脱落，将含RPE细胞的液体移入离心管中，离心1000r/min×8min，弃上清后，加入培养液，调整细胞密度1×105/L，将RPE细胞悬液接种于6孔板内，37℃，50mL/LCO2孵箱中培养。RPE传代培养同3讨论研究认为，PVR是眼组织对创伤修复反应的一种过度增殖的结果，其基本病理过程是原发性视网膜脱离或眼球穿通伤后的炎症反应，宿主细胞的游走、增生、膜形成，增生膜与视网膜粘连和收缩，形成对视网膜的牵拉，引起牵拉性

6、视网膜脱离。细胞迁移、增殖、收缩是形成PVR的关键病理过程，抑制这些病理过程的发展可防止PVR的形成。Ca2+作为细胞的第二信使及细胞增殖的启动因子，其浓度的变化对细胞生长及有丝分裂具有调控作用，同时第二信使Ca2+的变化是PVR发病机制之一[7]。国外研究发现降低细胞内Ca2+浓度可抑制RPE细胞增殖[8]，我们的前期工作已证明hRPE细胞冷冻后细胞内Ca2+浓度明显增高，因此推测细胞内游离Ca2+浓度的增高可能是hRPE细胞迁移和增殖的机制之一[9,10]。我们应用80mg/LVer作用体外培养的hRPE细胞，AO荧光染色、透射电镜和流式细胞术检测，可见典型的

7、凋亡改变，而且随着作用时间延长，细胞凋亡百分比逐渐增高，表明一定浓度Ver可诱导hRPE细胞凋亡。同时为研究hRPE细胞凋亡与细胞内[Ca2+]i关系，应用Fluo-3/AM荧光探针测定凋亡过程中hRPE细胞内[Ca2+]i的变化。Fluo-3/AM是新一代钙离子荧光染料，它在可见光谱激发，激发波长488nm，因而减少了需紫外光作激发时对活细胞的光损伤，其与Ca2+结合式的荧光强度较游离形式高40～100倍。因而避免了自发荧光的干扰。Fluo-3与Ca2+亲和力低，容易解离，适合测定细胞内Ca2+的快速、微量变化。Rosenthal等[11]在培养不同物种的RPE

8、细胞时发现