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1、拓扑特肯诱导人口腔上皮癌细胞凋亡的机制论文徐强，王枫，李等松，陈长生，徐文，缪珊【关键词】人口腔上皮癌细胞株【Abstract】AIM:TostudythemechanismofapoptosisofKBcellsinducedbyTopotecan(TPT).METHODS:MTTassayentofTPTfor12,24and48h,agarosegelelectrophoresisofgenomicDNAandfloetry(FCM)inetheapoptosisofTPTtreatedKBcellsand,theapop
2、tosisrateofthecellsicDNAofTPTtreatedKBcellsfor12hshoentations,typicalindexofapoptosisinbiochemistry.Thephosphorylationsofp38increasedgraduallyent(12,24and48h)(n=3,P0.05).CONCLUSION:TPTinducedapoptosisofKBcellsinvitromayresultfromtheenhancedactivationofp38MAPK.【Keyg/L
3、的TPT孵育12,24和48h,用MTT法检测TPT对KB细胞增殖的作用；DNA凝胶电泳和流式细胞仪技术检测TPT诱导KB细胞凋亡，APK的表达.结果:TPT处理细胞12,24和48h后,KB细胞的抑制率分别为(24±9)%,(34±7)%和(45±10)%,各组间有显著性差异(P0.05)；流式细胞仪检测其凋亡率，12h时(11.5±2.8)%.freela公司，p38一抗、二抗和pp38一抗、二抗及标准分子量蛋白Marker均购自美国SantaCruz公司，化学荧光显迹液化学荧光发光剂购自美国Pierce公司，预染标准分子质
4、量蛋白Marker购自美国BioRad公司；IMAGINGQUANT数据处理系统由提供.1.2方法1.2.1MTT实验检测Topotecan对KB细胞毒作用用含小牛血清100mL/L，青霉素100u/L,链霉素100mg/L的RPMI1640培养基在37℃,50mL/LCO2培养箱中培养KB细胞.0.25mg/L胰酶消化贴壁KB细胞,细胞密度为1×107个/L，于96孔培养板内接种100μL/孔(约800个细胞),培养24h.设对照组，给药组加入含有Topotecan25mg/L的RPMI1640培养基,每孔100μL,平行8个
5、孔，孵育12,24和48h后弃去培养液,每孔加入200μL浓度2g/LMTT培养液培养4h,弃上清,每孔加入150μLDMSO,轻度振荡,酶标仪在490nm条件下测定A值，用空白组调零.细胞抑制率用下式计算.细胞抑制率（%）=A对照组-A实验组〖〗A对照组×100%1.2.2TT实验结果选取含有Topotecan25mg/L的RPMI1640培养液培养KB细胞12,24和48h后，用冷的PBS洗2次（pH7.4），加入适量预冷的细胞裂解液（TrisHCll50mmol/L,pH7.4,10g/LNP40,1mmol/LEDTA,
6、1mmol/LNa3VO3,1mmol/LNaF,100mg/LPMSF,40ml/L蛋白酶抑制剂），冰浴15min,用吸管将细胞碎片连同细胞裂解缓冲液一起转移至经冷却的Eppendorf离心管中；4℃以15000g将裂解物离心10min，收集上清液，加入SDS加样缓冲液（100mmol/LTrisHClpH6.8,200mmol/LDTT,40g/LSDS,2g/L溴酚蓝，200mg/L甘油），沸水浴煮5min，将样品进行分装，保存于-80℃.蛋白质定量分析：用改进的Folin酚法定量蛋白.AGINGQUANT数据处理系统分析
7、结果.统计学处理：实验数据用x±s表示，组间差异比较用SPSS软件进行非参秩和检验，P0.05表示有统计学意义.2结果2．1不同浓度Topotecan对KB细胞增殖的抑制作用25mg/LTPT处理细胞12,24和48h后，KB细胞的抑制率分别为(24±9)%,(34±7)%和(45±10)%，与对照相比差异显著(P0.05)，各组间差异亦有显著性(P0.05).2.2流式细胞仪检测25mg/LTPT处理细胞12,24h后凋亡率分别为(19.4±2.8)%和(30.1±4.1)%，与对照组比较差异显著(P0.05,Fig1~3).
8、2.3DNA凝胶电泳25mg/LTPT处理细胞12h后，可见KB细胞DNA碎片化，是典型的细胞凋亡生化指标（Fig4）.2.4Topotecan作用下KB细胞pp38MAPK的表达25mg/LTPT处理细胞12,24和48h后，KB细胞的pp38MAPK表达分别
