阿霉素诱导鼻咽癌细胞凋亡的机制研究

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1、阿霉素诱导鼻咽癌细胞凋亡的机制研究阿霉素,又名14-羟基柔红霉素,为蒽环类抗生素，抗瘤谱较广，疗效高，是临床常用的抗肿瘤药物。除白血病外，其对膀胱癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、甲状腺癌、多发性骨髓瘤、乳腺癌、软组织肉瘤以及侵蚀性淋巴瘤等都有疗效[1].阿霉素抗肿瘤作用机制包括诱导肿瘤细胞凋亡、抑制细胞周期以及使肿瘤细胞发生自噬等[2].文献报道，阿霉素可能通过影响Bcl-2/Bax[3]、JNK凋亡通路[3]、p53凋亡通路[4]以及激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)[5]等诱导细胞凋亡，但其确切机制仍未十分明了。细胞凋亡早期出现的细胞容积减小称为凋亡性细胞皱缩(

2、apoptoticvolumedecrease,AVD),是具有普遍性意义的细胞凋亡早期的标志性事件。我们实验室前期研究表明，氯通道参与过氧化氢诱导的肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞凋亡[6]、紫杉醇[7]和丹参酮[8]诱导的低分化鼻咽癌E-2Z细胞的凋亡。这些结果提示多种抗肿瘤药物都可能通过激活氯通道引起AVD,继而诱导细胞发生凋亡，从而发挥其抗癌作用。本研究旨在探讨阿霉素是否通过激活细胞氯通道而诱导凋亡性细胞皱缩，从离子通道的角度来探讨阿霉素诱导E-2Z细胞凋亡的作用机制。1材料与方法1.1细胞培养用含10%小牛血清、双抗(1×105U·L-1青霉素与100

3、mg·L-1链霉素)的RPMI1640生长液，在37°C恒温培养箱(5%CO2、饱和湿度)内常规培养低分化鼻咽癌细胞(E-2Z),每两天传代1次。实验前取对数生长期的E-2Z细胞，用0.25%胰酶进行消化传代，收集、重悬细胞，将细胞悬液接种于直径22mm的圆形玻片上，置入培养箱使细胞贴壁，待细胞贴壁1h后进行实验。1.2主要试剂与药品盐酸阿霉素固体粉末购于上海生工生物有限公司，用二甲基亚砜(DMSO)溶解，配制成浓度为2.5mmol·L-1的储存液，储存在4℃冰箱中，使用前稀释至终浓度。氯通道阻断剂5-nitro-2-(3-phenylpropylamino

4、)-benzoate(NPPB)购自Sigma公司，溶于dimethylsulfoxide(DMSO)中，配成100mmol·L-1的储存液，工作浓度为100μmol·L-1.等渗灌流液组成(mmol·L-1):10HEPES,0.5MgCl2,70NaCl,140D-mannitol,2CaCl2,用冰点渗透压计(Osmomat030,Gono2tec)调节溶液渗透压至300mOsmol·L-1,用Tris-base调节pH至7.4.1.3细胞容积测量将贴有细胞的玻片置于灌流槽内，在倒置相差显微镜(IX71,Olympus,日本)下选择固定视野，用图像分析

5、软件(Image-ProPlus6.3,MediaCyberics,USA)控制数字式摄像机(RETIGA4000R,QImaging,Canada),进行连续拍摄，每2min拍摄一幅，直至2h.拍摄的图片用ScionImage图像分析软件(ScionCorporation)处理，测量细胞直径与面积，用以下公式计算细胞容积(V):V=4/3×(直径/2)3,并标准化细胞容积(Vst):Vst=(Vt/Vo)×100%(Vt:细胞的实际容积，Vo:药物刺激前即等渗条件下(对照)的细胞平均容积).实验分为空白对照组(Iso)、阿霉素组(ADM,2.5μmol·L

6、-1)、氯通道阻断剂NPPB组(100μmol·L-1)、阿霉素(2.5μmol·L-1)+NPPB(100μmol·L-1)组。实验环境温度为室温(20℃~24℃).1.4流式细胞术检测细胞凋亡细胞种植于6孔板中，培养箱中培养12h,按上述实验分组进行处理。36h后，收集细胞，用PBS冲洗，并用预冷的70%乙醇于-20℃固定30min.PBS清洗并离心，加入propidiumiodide(PI,50mg·L-1),室温避光染色15min.用流式细胞仪(CoulterEPTCSXL-31240,Coulter,USA)进行分析。1.5膜片钳全细胞记录技术EP

7、C-7膜片钳放大器(ListElectronic,Germany)用于记录全细胞电流，CED1401(Cambridge,UK)用于数字化(采样频率3kHz)电流和电压信号。拉制的电极是硼硅酸盐毛细玻璃管，其内径为0.86mm,外直径为1.5mm,内含细长丝，于垂直微电极拉制器(PB-7)上，分两步拉制。将电极内液充灌至电极容积的1/3至2/3间，此时阻抗约为(5-10)MΩ。全细胞记录模式构建完成后，开始记录实验数据。将细胞钳制在氯离子的平衡电位(0mV).按指令电压的顺序(±40,0和±80mV)循环记录氯电流变化。每一电位持续时间约200ms,两电位之

8、间间隔4s.形成全细胞记录后，补偿电容。灌流等渗液3