肝癌患者血浆rassf1a异常甲基化检测的意义

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1、肝癌患者血浆RASSF1A异常甲基化检测的意义赵强子，祁志芳,魏万礼，李开宗，窦科峰【关键词】肝肿瘤；RASSF1A基因；甲基化；血浆　　DiagnosticvalueofdetectionofaberrantlymethylatedRASSF1Ainplasmaofpatientsa　　【Abstract】AIM:TostudytheaberrantmethylationstatusofRasassociationdomainfamily1A(RASSF1A)intheplasmaofpatientsa(HCC)bymethylationspecificPCR(MSP),and

2、toexplorethevalueofcirculartumorrelatedDNAindiagnosisofHCC.METHODS:FreeDNAperipheralbloodplasmaof41HCCpatients.Aftermodifiedbisulfiteandpurified,theDNAplifiedusingprimersspecificformethylatedandunmethylatedsequencesofRASSF1A.RESULTS:AberrantRASSF1AmethylationaDNAinHCCpatients.NomethylatedRASS

3、F1Aasamples.Clinicaldataincludingage,sex,clinicalstages,levelsofAFP,hepatitisstatus,numberoftumor,invasion,metastasisandcirrhosisshoethylationofRASSF1A（P＞0.05）.AberrantlymethylatedRASSF1AasamplesofAFPnegativecases.CONCLUSION:DetectionofaberrantmethylationofRASSF1Ainbloodisfeasibletoearlydetec

4、tandscreenHCC,andisusefultoestimatetheprognosis.　　【Keys;Rasassociationdomainfamily1A;methylation;plasma　　【摘要】目的：采用甲基化特异性PCR法（MSP）检测41例原发性肝癌(HCC)患者血浆中游离Ras相关结构域家族蛋白1A(RASSF1A)异常高甲基化情况，探讨血浆RASSF1A检测在肝癌诊断中的意义.方法：收集患者血浆，提取游离DNA，亚硫酸氢钠修饰并纯化，以甲基化特异性引物及非甲基化引物进行PCR.结果：41例患者血浆中有17例RASSF1A呈现异常高甲基化（41.5％

5、），对照血浆均为阴性.患者一般情况、临床病理资料等与血浆中RASSF1A异常高甲基化检测结果无关（P＞0.05）；在10例AFP阴性的HCC患者中，有7例结果为阳性.结论：血浆RASSF1A甲基化检测对肝癌的早期诊断及筛选有重要意义，并有助于判断预后.　　【关键词】肝肿瘤；RASSF1A基因；甲基化；血浆　　0引言　　发现相对特异性的肿瘤标志物，尤其是能够起到早期筛选作用的标志物，对提高包括HCC在内的肿瘤诊断及治疗效果具有重要意义.肝癌组织中RASSF1A基因启动子区CpG岛异常高甲基化可达100％的检测结果〔1-2〕.我们在前期研究肝癌组织标本中RASSF1A基因启动子区异常

6、甲基化的基础上，观察患者血浆中RASSF1A基因启动子区异常甲基化情况，以证实其在肝癌诊断中的作用.　　1对象和方法　　1.1对象41例肝癌血浆全部收集自第四军医大学附属西京医院200310/200503手术治疗的患者，血浆于所有治疗未介入时采集，全部配对标本均经术后组织学证实为原发性肝细胞癌，其中男36例，女5例，全组平均年龄50.2岁.10例健康对照血浆来自健康献血者.　　亚硫酸氢钠购自Sigma公司，DNA纯化试剂盒购自Promega公司.引物由上海华大基因公司合成〔3〕，序列如表1所示.　　1.2方法　　1.2.1分组标准依照EdmondsonSteiner四级分法将标本

7、分为高/中分化组及低分化组；肿瘤分期依照国际抗癌联盟TNM分期标准分为Ⅰ/Ⅱ期、Ⅲ/Ⅳ期二组，HBV感染判定参照临床标准；血浆AFP检测结果按＜400ng/mL，≥400ng/mL分二组；病灶情况、血管累及、转移及肝硬化按照术中记录判断.表1引物序列及PCR反应条件（略）　　1.2.2DNA提取血浆DNA提取按照QIAampDNABloodMiniKit(QIAGEN)说明书进行，每份样本采用800μL血浆，提取产物分光光度计定量后-20℃保存.　　1.2.3甲基化特异性PCR(