肝癌患者血浆rassf1a,apc基因甲基化检测的临床应用价值

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1、河北医科大学硕士学位论文肝癌患者血浆RASSF1A，APC基因甲基化检测的临床应用价值姓名：赵慧金申请学位级别：硕士专业：内科学指导教师：李胜棉201203中文摘要肝癌患者血浆RASSFIA，APC基因甲基化检测的临床应用价值摘要目的：抑癌基因RASSFlA和APC基因分别是Ras和Wnt两个信号途径中的分子，以往已有一些研究证实在原发性肝癌(以下简称肝癌)组织中可检测到这两个基因的异常甲基化，但研究结论尚不一致。大多关于抑癌基因RASSFlA、APC启动子区域的DNA甲基化检测多采用新鲜组织，但组织标

2、本不适宜肝癌的筛选及早期检测，相较而言血浆标本比较容易获得。一些研究已经证明在肿瘤组织与配对血浆样本中DNA甲基化的改变有很高的一致性，表明血浆中DNA甲基化检测作为肿瘤标记物有潜在效用。本研究采用甲基化特异性聚合酶链反应(methylationspecificPCR，MSP)的检测方法，检测肝癌、肝硬化患者及健康人血浆中抑癌基因RASSFlA、APC的甲基化状态，研究其诊断价值，并分析其与临床资料及生存期预后的关系，为研究用于肝癌筛查、临床诊断及预后判断的血清学标记物提供更多依据。方法：1研究对象：2

3、007年5月至2011年9月于河北医科大学第四医院消化内科住院的肝癌患者102例，肝硬化患者80例及健康人100例作为对照。102例肝癌患者中，男性82例，女性20例，年龄在29～84岁，平均年龄为56．62±10．66岁，80例肝硬化患者中，男性患者57例，女性患者23例，年龄在23～78岁，平均年龄为58．68±10．28岁。依据国内临床诊断及分期标准(广州，2001)对肝癌进行临床诊断与分期，肝癌患者I期、II期幂nlii期的例数分别为8例、41例和53例。收集所有患者临床资料，通过电话联系对肝癌

4、患者进行随访。2抑癌基因启动子区域的甲基化检测方法：将经EDTA抗凝的全血2500rpm离心2分钟后取上清液得到血浆标本，用QIAampDNABloodMiniKit试剂盒提取血浆DNA，经亚硫酸盐处理后，用WizardDNA纯化纯化试剂盒纯化血浆DNA，具体步骤按试剂盒说明书进行，采用甲基化特异性PCR的方法(MSP法)。PCR扩增引物的序列：RASSFlA基因甲基化的引物序列为：上游引物中文摘要5’．GGGTTTTGCGAGAGCGCG-3’，—F潮I物5'-GATAACAAACGCGAACCG-3

5、’，非甲基化的引物序列为：上游引物5’GG(粥nW瞄mAGAGl瞄T(玛’，下游引物5'-ACTAACAAACACAAACCAAAC-3’：APC基因甲基化的引捌为：上游引物5’』rATTGCGGAG江1CK、(X3131℃弓’，—f毽鹋l物5’．T℃GACGAACTCCCGAOGA_3’，非甲基化的引物序列为：上游引物15’￡虱订兀Ⅲ叮K瓢AG阳瓜ⅪK狐弓’，下游引物5’-CCAATCAACAAACTCCCAACAA-3’。对抑癌基因RASSFlA，APC进行目的片段的扩增，扩增反应体系为2×HSTM

6、TaqMixKit，扩增产物通过电泳凝胶成像系统进行甲基化结果分析判定。3统计学分析：所有数据均使用SPSS13．0统计软件进行统计学分析，P<0．05认为有统计学意义。结果：l肝癌、肝硬化及健康人血浆中RASSFlA、APC基因甲基化状态及比较RASSFlA基因启动子区甲基化阳性率在肝癌和肝硬化血浆中分别为51．96％(53／102),I15％(12／80)，健康人血浆中未发现甲基化0％(0／100)，三组的甲基化阳性率的差异有统计学意义(贮=80．944，P=0．000<0．05)。对肝癌组及肝硬化

7、组血浆甲基化进行比较，差异有统计学意义(贮=26．677，P=-0．ooo)。健康人组分别与肝癌组及肝硬化组血浆甲基化进行比较，差异均有统计学意义(P--O．000，P=0．000)。APC基因启动子区甲基化阳性率在肝癌和肝硬化血浆中分别为47．05％(48／102)和22．5％(18／80)，健康人血浆中未发现甲基化0％(0／100)，三组的甲基化阳性率的差异有统计学意义(贮=62．429，P=0．000<0．05)，对肝癌组及肝硬化组APC基因甲基化进行比较，差异有统计学意义(x2=l1．700，P

8、=0．001)。健康人组分别与肝癌组及肝硬化组血浆甲基化进行比较，差异均有统计学意义(P=O．000，P=O．000)。2肝癌血浆中RASSFlA，APC基因甲基化状态与临床资料的比较RASSFlA和APC基因甲基化状态与患者的年龄、性别、Child—pu曲分级、AFP值大小无关，RASSFlA基因甲基化与肿瘤个数、是否伴有肝硬化、有无门静脉瘤栓及临床分期相关。RASSFlA基因甲基化阳性率在肿瘤多发和肿瘤单发肝癌血浆中分别为60％*I36