肝癌患者血浆rassf1a异常甲基化检测的意义论文

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1、肝癌患者血浆RASSF1A异常甲基化检测的意义论文赵强子，祁志芳,魏万礼，李开宗，窦科峰【关键词】肝肿瘤；RASSF1A基因；甲基化；血浆DiagnosticvalueofdetectionofaberrantlymethylatedRASSF1Ainplasmaofpatientsa【Abstract】AIM:TostudytheaberrantmethylationstatusofRasassociationdomainfamily1A(RASSF1A)intheplasmaofpatientsa(HCC)bymethylationspeci

2、ficPCR(MSP),andtoexplorethevalueofcirculartumorrelatedDNAindiagnosisofHCC.METHODS:FreeDNAperipheralbloodplasmaof41HCCpatients.Aftermodifiedbisulfiteandpurified,theDNAplifiedusingprimersspecificformethylatedandunmethylatedsequencesofRASSF1A.RESULTS:AberrantRASSF1AmethylationaD

3、NAinHCCpatients.NomethylatedRASSF1Aasamples.Clinicaldataincludingage,sex,clinicalstages,levelsofAFP,hepatitisstatus,numberoftumor,invasion,metastasisandcirrhosisshoethylationofRASSF1A（P＞0.05）.AberrantlymethylatedRASSF1AasamplesofAFPnegativecases.CONCLUSION:Detectionofaberrant

4、methylationofRASSF1AinbloodisfeasibletoearlydetectandscreenHCC,andisusefultoestimatetheprognosis.【Keys;Rasassociationdomainfamily1A;methylation;plasma【摘要】目的：采用甲基化特异性PCR法（MSP）检测41例原发性肝癌(HCC)患者血浆中游离Ras相关结构域家族蛋白1A(RASSF1A)异常高甲基化情况，探讨血浆RASSF1A检测在肝癌诊断中的意义.方法：收集患者血浆，提取游离DNA，亚硫酸氢钠修饰

5、并纯化，以甲基化特异性引物及非甲基化引物进行PCR.结果：41例患者血浆中有17例RASSF1A呈现异常高甲基化（41.5％）.freela公司，DNA纯化试剂盒购自Promega公司.引物由上海华大基因公司合成［3］，序列如表1所示.1.2方法1.2.1分组标准依照EdmondsonSteiner四级分法将标本分为高/中分化组及低分化组；肿瘤分期依照国际抗癌联盟TNM分期标准分为Ⅰ/Ⅱ期、Ⅲ/Ⅳ期二组，HBV感染判定参照临床标准；血浆AFP检测结果按＜400ng/mL，≥400ng/mL分二组；病灶情况、血管累及、转移及肝硬化按照术中记录判断.

6、表1引物序列及PCR反应条件（略）1.2.2DNA提取血浆DNA提取按照QIAampDNABloodMiniKit(QIAGEN)说明书进行，每份样本采用800μL血浆，提取产物分光光度计定量后-20℃保存.1.2.3甲基化特异性PCR(MSP)检测取5μg血浆DNA，97℃变性6min，加入亚硫酸氢钠（3.5mol/L）及对苯二酚（1mmol/L）55℃处理16h，结果参照SP法对41例患者血浆进行RASSF1A基因呈现异常高甲基化检测，结果17例为阳性，占总体41.5％，对照10份来自健康对照的血浆中无阳性结果（图1），说明相对于正常对照，肝

7、癌患者血浆中异常高甲基化的游离RASSF1A基因与肝癌自身有关.进一步将配对标本的MSP检测结果（已另文发表）对比后发现：血浆MSP检测结果阳性者全部为标本MSP阳性患者，符合率100％，血浆检测结果与其相应的肿瘤组织二者关系密切，说明血浆RASSF1A异常甲基化能较好的反应其肿瘤来源特异性.2.2统计分析按照表2中临床资料及血浆MSP检测结果，进行统计学处理发现，血浆RASSF1A基因异常甲基化与患者年龄、性别，血清AFP、HBV感染，以及肿瘤恶性程度、分期、病灶的大小、数目、侵犯及转移等均无关（P0.05），然而在AFP阴性（＜400ng/m

8、L）的10例患者中，有7例血浆MSP结果为阳性（表3）.41例血浆标本中，AFP阳性率75.6％（31/41）,敏感性优于RASSF1A