sp600125－jnk抑制剂对大鼠脑缺血再灌注神经元的保护作用论文

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1、SP600125－JNK抑制剂对大鼠脑缺血再灌注神经元的保护作用论文王宁薛荣亮姚凤珍何家璇【摘要】目的：探讨SP600125JNK特异性抑制剂对大鼠脑缺血再灌注神经元损伤的保护性作用及其作用机制.方法：雄性SD大鼠108只，体质量290~310g，随机分成假手术组（SH组），缺血再灌注组（IR组），JNK抑制剂SP600125组（SP组），分别于缺血前30min侧脑室注射10mL/LDMSO,10mL/LDMSO及JNK抑制剂SP600125.每组根据再灌注时间分为2,6,12,24,48和72h6个亚组，每亚组6只动物.采用4VO法建立SD大鼠全脑缺血模型，在预定时间点行灌注、固定、取

2、脑、石蜡包埋切片.freelia/reperfusioninratsanditspossiblemechanism.METHODS:108SDratslydividedintoshamoperationgroup(SH),ischemia/reperfusiongroup(IR)orJNKinhibitorSP600125group(SP).TheratsL/LDMSO(SHgroup),10mL/LDMSO(IRgroup)orSP600125(SPgroup)byintracerebralventricularinfusion30minbeforetheischemia,respecti

3、vely.APK信号通路之一JNK信号通路在脑缺血再灌注损伤过程中尤其是程序性细胞死亡过程中起着重要的调控作用［2］，但与DNA损伤修复有怎样的关系尚不清楚.本实验我们采用大鼠全脑缺血再灌注模型，应用组织病理学、TUNEL法凋亡细胞检测、免疫组织化学等方法探讨JNK信号通路抑制剂SP600125对大鼠脑缺血再灌注神经元的保护作用，及其与DNA损伤修复蛋白XRCC1的关系，以进一步探讨脑缺血再灌注损伤的分子机制.1材料和方法1.1材料成年雄性SD大鼠108只，体质量290~310g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供.术前在20~25℃环境中饲养1g/kg对大鼠腹腔注射施行麻醉（所有动物麻醉

4、均与此相同），仰卧位固定，颈前正中切口，分离双侧颈总动脉，穿线留置备用，缝合颈部切口.改俯卧位固定，颈后正中切口，逐层分离肌肉，暴露第一颈椎翼小孔，用烧红的探针插入翼小孔，烧灼双侧椎动脉，使之永久闭塞.放回鼠笼.术后第2日，麻醉后仰卧位固定，剪开切口缝线，沿昨日留置线再次游离暴露双侧颈总动脉，予以微动脉夹夹闭6min，松开微动脉夹恢复脑血流.颈总动脉夹闭2min内瞳孔不散大者弃之.SH组仅游离暴露双侧颈总动脉，不予微动脉夹夹闭.三组动物在夹闭双侧颈总动脉前30min分别侧脑室注射10mL/LDMSO,10mL/LDMSO和SP600125（SP600125溶于10mL/LDMSO,）各10μ

5、L，药物在5min内注完，留针2min.1.2.3组织学观察在预定时间点，10g/L戊巴比妥钠40mg/kg对大鼠腹腔注射施行麻醉，开胸，经升主动脉依次灌注0.1mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）100mL和40g/L多聚甲醛300mL固定，取脑.取视交叉后1~4mm脑块进行石蜡包埋，冠状面切片，切片厚5μm.切片行HE染色，在400倍光镜下计数CA1区中段100单位长度内存活神经元数目.1.2.4原位细胞凋亡TUNEL法检测取海马冠状石蜡切片，常规二甲苯、乙醇脱蜡至水.蛋白酶K（20mg/L）室温消化，用甲醇配制的30mL/L过氧化氢消除内源性辣根过氧化酶活性，加末端脱氧核糖核酸转移酶（Td

6、T）与地高辛标记的dUTP混合反应进行孵育，再加辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体进行孵育，用DAB显色，核呈深棕黄色者为凋亡细胞，最后复染、脱水、透明、封片.在400倍光镜下计数海马CA1区中段100单位长度内TUNEL染色阳性细胞数目.定量分析方法为：光镜下计算凋亡指数（ApoptosisIndex,AI）.凋亡指数计算方法：分别计算凋亡细胞数和总细胞数，AI=凋亡细胞数/总细胞数×100%.1.2.5免疫组织化学取海马冠状石蜡切片，采用SABC法行免疫组化法.XRCC1多抗稀释度为1∶100.切片依次脱蜡至水，30mL/L过氧化氢孵育10min，三蒸水冲洗5min.PBS（pH7.4）浸

7、泡5mim，电炉水浴抗原修复，加热至95℃15~20min后，自然冷却至室温.滴加正常山羊封闭血清，室温孵育1h，侵去勿洗.滴加1∶100的XRCC1多抗，放入4℃冰箱过夜.PBS冲洗5min，3次，擦干切片周围水分后，滴加生物素标记的二抗，37℃温箱孵育1h，PBS冲洗5min，3次，擦干切片周围水分后，滴加SABC复合物，放入37℃温箱孵育20min.三蒸水洗5min，3次，DAB显色，脱水、透明、封片.