脂质体介导的vegfc反义寡核苷酸对肺癌微淋巴管生成的影响

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1、脂质体介导的VEGFC反义寡核苷酸对肺癌微淋巴管生成的影响作者：丁成智钱永跃郭旭峰徐中华徐忠恒【摘要】　　目的观察脂质体介导的血管内皮生长因子C(VEGFC)反义寡核苷酸对肺癌裸鼠皮下种植瘤模型微淋巴管生成的影响。方法建立BALB/C小鼠皮下肺癌模型30只，随机分为磷酸盐缓冲液对照组(PBS组)、正义寡核苷酸对照组(SODN组)和反义寡核苷酸干预组(AODN组)。接种人肺腺癌细胞株A549后24h内，分别用PBS、SODN及AODN皮下注射进行治疗，观察小鼠肿瘤的生长情况。4RNA和蛋白表达量降低(4.61±1.57),与对照组比较差异显著(P<0.05

2、)；种植瘤内微淋巴管密度为(3.2±1.7)，明显低于对照组(P<0.01)。结论脂质体介导的VEGFC反义寡核苷酸可以显著降低肺癌裸鼠皮下种植瘤模型VEGFC的表达水平，并对其微淋巴管生成具有较强抑制作用。【关键词】肺癌；血管内皮生长因子C；基因治疗　　非小细胞肺癌(NSCLC)约占肺癌80%，随着对综合治疗和个体化治疗的认识不断加深和推广，NSCLC的治疗已经有了很大提高，但目前5年生存率仍低于15%〔1〕。一般认为，肿瘤细胞的侵袭性和转移性是决定肿瘤类型和患者死亡的主要原因，因此明确肿瘤细胞转移和肿瘤细胞之间相互作用的分子机制对肿瘤的治疗有重要意

3、义。目前认为，抗肿瘤的血管生成和淋巴管生成是有效治疗肿瘤的主要途径之一〔2〕。我们前期研究结果已经证实，肺癌细胞通过高表达血管内皮生长因子C(VEGFC)与淋巴管内皮细胞VEGFR3特异性结合刺激肺癌新生淋巴管生成〔3〕。本研究通过建立肺癌裸鼠皮下种植瘤模型，研究脂质体介导的VEGFC反义寡核苷酸对肺癌细胞VEGFC表达水平和种植瘤内微淋巴管生成的影响，来寻找肺癌基因治疗新方法。　　1材料与方法　　1.1材料　　1.1.1细胞及动物　　肺癌A549细胞株由山东大学齐鲁医院胸外科胡国强教授惠赠，生长特性为贴壁生长，传代培养。4～6周龄雌性BALB/C系裸鼠3

4、0只，购自上海斯莱克实验动物有限公司。　　1.1.2主要试剂　　RPMI1640培养基购自GIBCO公司,胎牛血清系杭州四季青产品。全硫代磷酸化修饰的寡核苷酸均由上海生工公司合成，VEGFC反义寡核苷酸序列为5′CCCACATCTGTAGAGGGAGGACTC3′，正义寡核苷酸序列为5′TACGTAGTATGGTGTACGATC3′；RTPCR试剂购自Promega公司。VEGFC上游引物序列为5′CATGTACGAACCGCCAG3′,下游引物序列为5′TTGGCTGTTTGGTCATTGGC3′，扩增产物320bp，βactin上游引物

5、序列为5′ACGTCTGCTGGAAGGTGGAC3′，下游引物序列为5′GGTACCACCATGTACCCAGG3′，扩增产物163bp，由上海生工公司合成。兔抗人多克隆抗体VEGFC、VEGFR3及免疫组织化学试剂盒PV9000均购自北京中山生物技术公司。　　1.2实验方法　　1.2.1人肺腺癌细胞株A549裸鼠皮下种植瘤模型建立和分组　　取对数生长期A549细胞，经2.5g/L胰酶+0.2g/LEDTA消化液消化后，PBS洗涤2次，离心5min(1500r/min)，弃上清，加生理盐水制成单细胞悬液，细胞密度为1×106个/ml，以0.2ml/

6、只接种于BALB/C小鼠右腋皮下。建模1g。按1μg∶2μl的比例将AODN和SODN及脂质体轻柔混匀，室温下静置30min，制成Lip+ODN复合物。　　1.2.3干预方法和动物取材　　寡核苷酸用量为每次10mg/kg体重，隔日1次，每周3次，共3l浓度为8mg/μl的正义和反义VEGFC寡核苷酸PBS溶液给SODN和AODN组小鼠注射，PBS组仅注射0.2mlPBS。第4周末时所有动物模型均存活，颈椎脱臼法处死裸鼠，立即剖出肿瘤，置入10%中性甲醛常规固定标本石蜡包埋，行HE染色。　　1.2.4种植瘤内VEGFCmRNA和蛋白表达量检测　　按照Trizol

7、试剂盒说明提取种植瘤中总RNA，用引物OligodT反转录(RT)合成cDNA链，RT反应产物用作PCR的模板DNA，使用特异性引物进行PCR，βactin作为内参照。取10μlPCR产物在2%琼脂凝胶电泳，紫外灯下观察电泳带，应用SmartVieRNA水平。ol/LPBS代替一抗。VEGFR3蛋白阳性表达产物定位于微淋巴管内皮细胞，呈棕红色颗粒。肿瘤微脉管计数方法：判定标准为由内皮细胞形成条状、隙状等孤立或簇状结构棕红染色及有管腔者，先在低倍光镜(×40)视野下寻找癌周组织微脉管最密集区即“热点”(hotspot)，然后在高倍镜(×200)下观察，以4个高倍

8、镜视野脉管