联合转染反义寡核苷酸survivin和vegf抑制肺癌a549细胞生长的研究

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1、硕士专业学位论文论文题目联合转染反义寡核苷酸Survivin和VEGF抑制肺癌A549细胞生长的研究颜洁研究生姓名朱雪明指导教师姓名临床检验诊断学专业名称肿瘤分子生物学研究方向2013年6月论文提交日期联合转染反义寡核苷酸Survivin和VEGF抑制肺癌A549细胞生长的研究中文摘要联合转染反义寡核苷酸Survivin和VEGF抑制肺癌A549细胞生长的研究中文摘要目的：本实验针对Survivin和VEGFmRNA序列设计反义寡核苷酸（ASODN），以脂质体（Lip）为载体，应用Survivin和VEGFASODN联合转染非小细胞肺癌A549细胞株，探讨同时抑制Survivin和V

2、EGF两个基因对肺癌细胞增殖、凋亡以及基因表达的影响，为非小细胞肺癌双靶点基因治疗提供实验依据。方法：①将实验分为7组，Blank组：A549细胞；Lip组：Lipofectamine2000转染A549细胞；SurvivinSODN组；VEGFSODN组；SurvivinASODN；VEGFASODN；Survivin+VEGF组：SurvivinASODN和VEGFASODN联合转染A549细胞。②利用反义寡核苷酸技术，以脂质体（Lip）为载体，分别介导200、400、600nmol/LSurvivinASODN和5、10、20µmol/LVEGFASODN单独转染A549细胞，

3、镜下观察转染后的细胞形态变化，转染24h、48h、72h、96h后，MTT法检测细胞生长抑制率，RT-PCR测定细胞中Survivin和VEGF基因mRNA表达。③用脂质体介导400nmol/LSurvivinASODN和10µmol/LVEGFASODN联合转染A549细胞，48h后观察联合转染组细胞形态变化，MTT检测细胞增殖情况，RT-PCR检测Survivin和VEGFmRNA表达，流式细胞仪（FCM）检测细胞凋亡和Survivin蛋白表达。结果：①显微镜下Blank组、Lip组、SODN组细胞形态完整、贴壁良好，ASODN组细胞形态不规则、生长减慢，Survivin+VEG

4、F组细胞皱缩、成簇状漂浮；②MTT结果显示A549细胞分别经200、400、600nmol/LSurvivinASODN和5、10、20µmol/LVEGFASODN转染，孵育24h，48h，72h，96h后细胞生长出现不同程度的抑制，与Blank组、Lip组、SODN组相比，细胞增殖抑制率显著升高（P<0.05）；且SurvivinASODN和VEGFASODN抑制作用均在48h达到高峰，随孵育时间增加，抑制作用逐渐减弱；③ASODN组抑制作用呈剂量依赖性，其中SurvivinASODN在400nmol/L浓度处出现明显的抑制效果，细胞增殖抑制率为（49.24±1.15）%，与20

5、0nmol/LI中文摘要联合转染反义寡核苷酸Survivin和VEGF抑制肺癌A549细胞生长的研究（39.54±1.93）%相比显著增高（P<0.05），mRNA相对含量明显降低（P<0.05）；VEGFASODN在10µmol/L浓度处出现明显的抑制效应，抑制率为（39.54±1.44）%，抑制作用比浓度为5µmol/L（27.47±1.30）%时明显增强，mRNA表达也显著降低，两者差异均具有统计学意义（P<0.05）；④400nmol/LSurvivinASODN和10µmol/LVEGFASODN转染A549细胞48h后，Survivin+VEGF组的细胞生长抑制率为（61

6、.37±1.94）%，较单独转染SurvivinASODN（50.44±1.13）%和VEGFASODN（39.33±1.99）%的抑制效果明显增加(P＜0.05)；⑤AnnexinV-FITC/PI双标记细胞后流式细胞仪检测Survivin+VEGF组A549细胞凋亡率为（57.03±1.61）%，显著高于SurvivinASODN（22.33±2.41）%和VEGFASODN（18.28±1.13）%单独转染组，差异具有统计学意义(P＜0.05)；⑥RT-PCR结果显示Survivin+VEGF组SurvivinmRNA和VEGFmRNA相对含量分别为（15.26±1.31）%和

7、（13.12±1.45）%，较Blank组、Lip组、SODN组、ASODN组显著降低（P<0.01），ASODN组中单个基因被抑制，另一基因mRNA表达也出现下调；⑦流式检测Survivin蛋白表达率，Survivin+VEGF组为（30.40±1.33）%、SurvivinASODN组为（41.41±1.19）%、VEGFASODN组为（46.84±1.72）%，双基因ASODN联合转染对Survivin蛋白表达的抑制强度明显高于单独转染组（P<0.0