联合转染survivin和bcl2反义寡核苷酸对裸鼠胆囊癌生长的抑制作用

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1、联合转染Survivin和Bcl2反义寡核苷酸对裸鼠胆囊癌生长的抑制作用【摘要】目的探讨联合转染Survivin和Bcl2反义寡核苷酸（AsODN）对裸鼠胆囊癌生长抑制作用。方法建立裸鼠胆囊癌皮下移植瘤模型，选择36只裸鼠随机分为3组：对照组、正义寡核苷酸（sODN）组和AsODN组，裸鼠瘤体内分别注射PBS、Survivin和Bcl2sODN、Survivin和Bcl2AsODN，12d后处死裸鼠，测量瘤体体积及质量，计算抑瘤率；苏木精伊红染色观察瘤体组织学变化；免疫组织化学方法检测Survivin及Bcl2蛋白的表达。结果AsODN

2、组裸鼠瘤体平均体积显著低于对照组、sODN组（F=24.469，q=8.802、7.569，P<0.01），其体积抑瘤率为55.53%，sODN组为9.90%；AsODN组裸鼠瘤体平均质量显著低于对照组、sODN组（F=25.376，q=3.168、20.737，P<0.01），其质量抑瘤率为56.24%，sODN组为8.47%。AsODN组瘤体中可见大量的凋亡细胞。免疫组化证实AsODN组Survivin表达明显降低，同sODN组相比差异有显著意义（F=15.103，q=5.883、7.191，P<0.01）；Bcl2表达亦

3、明显降低，同sODN组相比差异有显著性（F=6.632，q=4.793、4.030，P<0.05）。结论联合转染Survivin和Bcl2AsODN可下调Survivin和Bcl2表达，诱发细胞凋亡，从而抑制裸鼠胆囊癌种植瘤的生长。【关键词】胆囊肿瘤寡核苷酸反义SurvivinBcl2模型动物［ABSTRACT］ObjectiveToevaluatetheinhibitoryactionofbiningantisenseoligonucleotidetargetingSurvivinandBcl2ongroainnudemouse.

4、MethodsAmodelofhumangallbladdercarcinomatransplantedsubcutaneouslyinnudemiceiceeofthetumoreasuredandhistologyobservedbyHEstaining,theexpressionofsurvivinandBcl2proteindetectedbyimmunohistochemistrySABCmethod.ResultsThemeanvolumeandorsofAsODNgroupeandarkedlyloorsinnudemice,th

5、ereasonmightbethattheycoulddoacell.［KEYI1640培养液及小牛血清购自杭州四季青公司。兔抗人Survivin多克隆抗体、兔抗人Bcl2多克隆抗体、SABC及DAB显色试剂盒均购自武汉博士德生物工程公司。1.1.3细胞株胆囊癌细胞株GBCSD系山东大学齐鲁医院普外科构建。1.1.4实验动物BALB/cnu/nu裸小鼠，4～6周龄，雌雄兼用，体质量18～23g，购自中国医学科学院实验动物研究所。1.2实验方法1.2.1裸小鼠胆囊癌模型的建立取处于对数生长期1×1010/L的GBCSD胆囊癌细胞，于每只裸鼠

6、一侧背部皮下接种0.2mL单细胞悬液，以皮下结节直径超过0.5cm为成瘤标准。所有裸鼠于接种细胞后2周左右成瘤，成瘤率100％。1.2.2抑制种植瘤实验取成瘤后裸鼠36只，称体质量后随机分为3组，每组12只。对照组每只裸鼠瘤体内多点注射PBS0.3mL，sODN组每只裸鼠瘤体内多点注射50μL脂质体(Lipofectin)+SurvivinsODN及Bcl2sODN各100μg（0.3mL），AsODN组每只裸鼠瘤体内均行多点注射50μL的Lipofectin＋SurvivinAsODN及Bcl2AsODN各100μg（0.3mL），每天注射

7、1次。于注射后12d断颈处死裸鼠，剥离肿瘤，分别测量肿瘤长轴（L）、短轴（ax×100%。其中Gα为切片中所测内容的平均灰度，Gβ为切片中的背景灰度，Gmax为最大灰度值。1.2.5细胞组织学观察组织切片采用苏木精伊红染色方法染色。1.3统计学方法采用SPSS11.5forWindows统计软件进行数据处理，数据间比较采用单向方差分析（LSD法）。2结果2.1联合转染SurvivinAsODN和Bcl2AsODN对裸鼠胆囊癌生长的抑制作用裸鼠成瘤后，经过12d的治疗，AsODN组裸鼠肿瘤体积明显小于对照组和sODN组，差异有显著性（F=24.

8、469，q=8.802、7.569，P<0.01），而对照组和sODN组之间的差异无显著意义（P>0.05）。AsODN组裸