脂质体介导的vegfc反义寡核苷酸对肺腺癌细胞系 a549生长、凋亡的影响

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1、脂质体介导的VEGFC反义寡核苷酸对肺腺癌细胞系A549生长、凋亡的影响作者：郭旭峰徐中华陈勇兵杨文涛徐忠恒钱永跃【摘要】　　目的探讨脂质体介导的血管内皮生长因子C（VEGFC）反义寡核苷酸对肺腺癌细胞系A549生长、凋亡的作用。方法将A549细胞随机分为磷酸盐缓冲液对照组(PBS组)、正义寡核苷酸对照组(SODN组)和反义寡核苷酸转染组(AODN组),应用细胞计数方法计数每组细胞数，苏木精伊红（HE）染色法观察细胞形态及分布，流式细胞仪分析A549细胞凋亡情况。应用I1640培养基购自Gibco公司，胎牛血

2、清系杭州四季青产。全硫代磷酸化修饰的寡核苷酸均由上海生工公司合成，VEGFC反义寡核苷酸序列为5′CCCACATCTGTAGAGGGAGGACTC3′，正义寡核苷酸序列为5′TACGTAGTATGGTGTACGATC3′。兔抗人多克隆抗体VEGFC购自北京中山生物技术公司。　　1.2实验分组　　取对数生长期A549细胞，以1×105/孔接种至6孔板，待其生长至90％融合时，用Lipofectamine2000脂质体介导，将AODN、SODN转染到A549细胞内，SODN组以4μg/ml浓度转染，AODN

3、组设计2种浓度：4、8μg/ml，分别于转染24及48h后终止。以等体积磷酸盐缓冲液代替寡核苷酸转染作为阴性对照组（PBS组）。　　1.3A549细胞形态学观察　　根据实验时相，95%的酒精固定5～10min后，行HE染色后自然晾干，在油镜下观察A549细胞的形态特点及各时相细胞形态的变化。　　1.4A549细胞生长特性观察　　胰酶消化收集6孔板中的细胞，进行准确的细胞计数，绘制细胞生长曲线。　　1.5流式细胞仪观察A549细胞周期时相分布及凋亡率　　每个实验组各时相的细胞计数完毕、收集后，离心5min（800r/

4、min），PBS洗1次，1%多聚甲醛固定后，用PBS再洗2次，加碘化丙锭（PI）0.5ml，避光反应20min，上机检测，仪器同时测定DNA荧光强度及散射光参数，并用随机软件CELLQuest定量细胞凋亡数目及细胞周期分布。　　1.6VEGFC蛋白的检测　　对生长在含5%胎牛血清的RPMI1640培养基中的A549细胞,VEGFC反义寡核苷酸转染,48h后提取细胞蛋白,Western印迹检测VEGFC基因表达。同时检测βactin的蛋白表达量作为内参照。　　1.7统计学方法　　应用SPSS13.0软件包进行

5、方差分析。　　2结果　　2.1VEGFC反义寡核苷酸对A549细胞生长、凋亡的影响　　人肺腺癌细胞A549在应用脂质体介导的VEGFC反义寡核苷酸转染后，从12h开始，细胞生长明显受抑，且呈浓度依赖性，以8μg/ml浓度时受抑最强(P<0.01)，SODN组和PBS组A549细胞的受抑制作用转染前后无显著性差异(P>0.05)。经HE染色后，镜下见转染前A549细胞生长旺盛，胞核大，核仁多且核分裂明显，细胞棘突多而长，相互间连接紧密。转染后，SODN组和PBS组A549细胞生长无明显变化，AODN组

6、A549细胞在培养12h后生长明显受抑，胞核变小，核分裂像明显少见，见图1。流式细胞仪检测结果显示A549细胞自转染后12h起，AODN组细胞凋亡率均显著高于对照组(P<0.01)，且8μg/ml组凋亡率也明显高于4μg/ml组(P<0.05)，呈现浓度依赖关系，见图2。　　2.2，HandisulyaA,etal.Vascularendothelialgroouscellcarcinomasoftheheadandneck〔J〕.HeadNeck,2003;25(4)：46474.　　4Ishika

7、aJ，KazamaS,etal.Expressionofvascularendothelialgroportantriskfactorforlymphaticmetastasisinundifferentiatedearlygastriccarcinoma〔J〕.JpnJClinOncol,2003;33(1):217.　　5RobertsN，KloosB，CassellaM,etal.InhibitionofVEGFR3activationorepotentlysuppresseslymphnodeanddi

8、stantmetastasisthaninactivationofVEGFR2〔J〕.CancerRes,2006;66(21):26507.　　6LinJ，LalaniAS，HardingTC,etal.Inhibitionoflymphnodemetastasisusingadenoassociatedvirusmediatedgenetran