青藤碱对肺腺癌细胞系a549增殖和凋亡的影响

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1、青藤碱对肺腺癌细胞系A549增殖和凋亡的影响【摘要】目的研究青藤碱(SIN)对肺癌A549细胞增殖的影响及其机制，为SIN预防和治疗肺癌提供实验依据。方法SIN高(1.0mmol/L)、中(0.5mmol/L)、低(0.25mmol/L)剂量组及空白对照组分别处理体外培养的人肺癌细胞系A549细胞后，采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测处理24、48、72h后A549细胞的增殖活性;采用流式细胞仪测定各剂量组SIN作用48h后细胞周期;采用流式细胞术和TUNNEL方法检测细胞凋亡。结果高、中、低剂量组SIN处理A

2、549细胞48、72h后，细胞增殖明显受到抑制，且呈时间、剂量依赖性。SIN处理组G1期细胞比例明显增加，与空白对照组比较有统计学意义。SIN处理组细胞凋亡率也较对照组升高，呈剂量依赖性。TUNNEL法可见凋亡细胞的阳性反应。结论SIN在体外能有效抑制肺癌细胞生长，其机制与其阻滞细胞周期于G1期、诱导细胞凋亡有关。【关键词】肺癌;青藤碱;细胞凋亡青藤碱(SIN)是抗风湿中药青风藤(SinomeninumscutumRehd.etI1640培养基(Gibco公司);0.25%胰蛋白酶(以色列Biological

3、Industries公司);胎牛血清(天津索莱宝生物工程有限公司);四甲基偶氮唑蓝(MTT，南京凯基生物科技发展有限公司);二甲基亚砜(DMSO)、碘化丙啶(PI)与RNA酶(Sigma公司);AnnexinVPI双染试剂盒(欣博盛生物科技发展有限公司);酶标仪(BioRad550,美国)、倒置显微镜(OlympusX70型，日本);超净工作台(蚌埠净化设备厂)、离心机(Eppendorf525L型，德国);流式细胞仪(BECTONDICKINSON，美国)。　　1.2细胞培养及分组用含10%小牛血清的5

4、6℃灭活胎牛血清的RPMI1640培养基在37℃，饱和湿度、5%CO2的培养箱中培养。细胞呈单层贴壁生长，实验均取对数生长期细胞，调整细胞浓度为0.5×106～1×106/ml。接种细胞24h进入对数生长期后开始进行药物干预。　　1.3MTT法检测细胞增殖细胞调整成浓度为5.0×104/ml的细胞悬液，接种于96孔板，每孔100μl，实验设6个复孔，并设空白对照。接种24h，镜下观察确认细胞贴壁良好。实验组加系列稀释的高、中、低剂量SIN溶液，使终浓度依次为(1.0,0.5,0.25mmol/L)。实验设含R

5、PMI1640全培养基的空照和未予药物作用的阴性对照。细胞在37℃,CO2培养箱分别培养24、48、72h。结束培养前4h小心吸去细胞培养液，每孔加MTT20μl，37℃继续培养4h后小心吸去上清，每孔加DMSO150μl，振荡混匀10min，使甲瓒溶解。酶标仪检测波长570nm的每孔光密度值(OD值)。实验重复3次。增殖抑制率=1-加药组OD值/对照组OD值×100%　　1.4流式细胞技术(FCM)检测SIN对A549细胞周期的作用细胞以1×106接种于6孔板中，加入终浓度为系列稀释的高、中、低剂量SIN溶

6、液，使终浓度依次为(1.0,0.5,0.25mmol/L)，并设空白对照组(加等量RPMI1640培养基)，分别于37℃、5%CO2和饱和湿度条件下培养48h后0.25%胰酶消化,加含血清培养基中和胰酶后收获细胞，以1500r/min，4℃离心8min。沉淀用冷PBS洗涤并离心2次后，用75%预冷酒精重悬固定过夜。检测前将细胞悬液离心后PBS洗涤1次，加入PI染液1ml(50μg/ml)，混匀后4℃避光放置30min，以FACSCallbur型流式细胞仪检测分析，结果用专业软件ModFit获取分析数据。每组实

7、验重复3次。　　1.5流式细胞技术AnnexinVFITC法检侧A549细胞凋亡细胞以1×106接种于6孔板中，培养24h后加入终浓度为系列稀释的高、中、低剂量SIN溶液，使终浓度依次为(1.0,0.5,0.25mmol/L)，并设空白对照组(加等量RPMI1640培养基)，37℃、5%CO2和饱和湿度条件下培养48h后胰酶消化收获细胞。空白对照组以培养基替代SIN离心收集悬浮细胞，2000r/min，离心8min，弃培养基。用冷PBS洗涤离心细胞2次。用400μl1×BindingBuffer悬浮细胞，浓

8、度大约为1×106个/ml。在细胞悬浮液中加入5μlAnnexinVFITC，轻轻混匀后于4℃避光条件下孵育15min。加入10μlPI后轻轻混匀于2℃～8℃避光条件下孵育5min。在1h内用流式细胞仪检测。结果用Cellquest专业软件获取分析数据。每组实验重复3次。　　1.6TUNNEL检测凋亡实验分组：对照组、SIN处理组。接种处于对数生长期的细胞到75cm2培养瓶中，24h