血管内皮生长因子c反义脱氧寡核苷酸对肺癌a549细胞株侵袭力的影响

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1、血管内皮生长因子C反义脱氧寡核苷酸对肺癌A549细胞株侵袭力的影响：彭传亮丛波田辉孙启峰赵小刚贠灿华【摘要】目的研究血管内皮生长因子C(VEGFC)反义寡核苷酸(antisenseoligodeoxyribonucleotide，ASODN)对人肺癌细胞株A549体外侵袭力的影响。方法应用脂质体介导的VEGFC正义、反义寡核苷酸转染人肺癌细胞株A549细胞，并设对照组，检测癌细胞的侵袭力变化。结果经VEGFCASODN转染的A549细胞株黏附能力显著降低(P<0.01)，对重组基底膜体外侵袭能力明显减弱(P<0.01)。结论VE

2、GFCASODN能够明显抑制肺癌细胞株A549体外侵袭力。【关键词】血管内皮生长因子C;反义;寡核苷酸;A549细胞;肺癌;侵袭力肺癌是我国目前最常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率逐年上升,尽管以手术为主的综合治疗取得较大进步，但其预后仍不尽人意，有必要尝试寻找治疗肺癌的新途径。经淋巴管转移是肺癌重要的转移途径，血管内皮生长因子C(VEGFC)作为血管内皮生长因子家族成员之一，在癌周组织存在一定程度的表达，并具有促进肿瘤细胞生长、促进血管生成的作用〔1〕，因此能够成为肺癌基因治疗的极好靶点。目前关于肺癌VEGFC靶向治疗的研究较少〔2〕，本研究

3、采用VEGFC反义寡核苷酸(antisenseoligodeoxyribonucleotide，ASODN)转染肺癌细胞株A549，探讨其对肺癌细胞侵袭能力的影响，为肺癌的基因治疗提供有意义的理论依据。　　1资料与方法　　1.1材料　　1.1.1肺癌细胞株人肺癌细胞株A549购自中科院上海细胞所,将其接种于含10%小牛血清的RPMI1640培养基，置37℃、5%CO2培养箱中常规培养至80%后备用。　　1.1.2主要试剂寡核苷酸(oligodeoxyribonucleotide，SODN)、ASODN由上海生物工程公司合成并硫代磷酸化修饰;阳离子

4、脂质体LipofectamineTM2000(LIP)为美国Invitrogen公司产品;RPMI1640(含L谷氨酰胺)培养液为GibcoBRL公司产品;Matrigel、TransineTM2000说明书，寡核苷酸(μg)∶LIP(μl)=1∶2.5比例混合配制。根据转染复合物的类别分为4组：空白对照组;LIP组(LIP转染);SODN组(SODN转染);ASODN组(ASODN转染)，终浓度1333ng/ml，荧光显微镜下观察转染30min细胞内便有荧光标记的寡核苷酸出现，随着时间的延长，细胞内的荧光越来越强，转染6～12h细胞内的荧光最强,转

5、染率70%左右。转染48h后收集细胞进行检测。　　1.2.2黏附实验将96孔板用Matrigel5μg包被，2%BSA封板处理。每孔加入5×104个不同预处理肺癌细胞，置37℃、5%CO2培养箱培养，分别于30、60、90、120min各时间点弃去培养液，PBS冲洗除去未黏附的细胞。每孔加MTT20μl，以及无血清RPMI1640200μl，CO2培养箱孵育4h;吸弃上清液，加DMSO200μl振荡10min后，自动酶标仪570nm测各孔吸光度(A570)值，计算细胞黏附率。每组设6个复孔，重复3次。细胞黏附率=(实验组A570值/对照组A570值)×

6、100%。　　1.2.3侵袭实验将基质胶按40μl/孔均匀地铺在侵袭小室聚碳酯膜上,成胶30min后,置紫外灯下照射过夜，实验前30min再次成胶。取不同预处理细胞各104个(RPMI1640液200μl)分别接种到成胶的侵袭小室上,在24孔板内加入NIH/3T3细胞上清液(趋化因子)，每孔600μl，37℃，5%CO2培养24h后取出侵袭小室，用棉签头擦掉基质胶，PBS液洗3次，95%乙醇固定15min，HE染色，揭下侵袭小室聚碳酯膜反贴在载玻片上。结果判定：400倍光镜下随机计数5个视野的穿膜细胞数，取均值。实验重复3次。　　1.3统计学方法数据以x

7、±s表示，采用SPSS12.0软件进行方差分析和q检验。　　2结果　　2.1VEGFCASODN对肺癌细胞黏附能力的影响随着时间的延长，各处理组细胞黏附能力均增加;同一时间点ASODN组　　细胞黏附率较其他三组明显降低(P<0.01)，空白对照组、LIF组和SODN组之间差异不显著(P>0.05)，见表1。表1MTT法检测处理后各组细胞不同时间的黏附率(x±s)　　2.2VEGFCASODN对肺癌细胞侵袭能力的影响与空白对照组、LIF组和SODN组(132.5±15.6;129.7±16.1和118.2±12.5)相比，ASODN组48h

8、浸润细胞数明显减少(58.6±9.2)(P<0.01)，对重组基底膜体外侵