血管内皮生长因子165基因对人胃癌细胞侵袭性的影响

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1、血管内皮生长因子165基因对人胃癌细胞侵袭性的影响：乐红琴，欧希龙，杭程，陈慧娟【摘要】目的：探讨血管内皮生长因子165(VEGF165)基因对胃癌细胞侵袭性的影响及可能机制。方法：通过体外培养人胃腺癌细胞BGC823，观察胃癌细胞转染VEGF165基因对其迁移能力及侵袭相关分子MMP2、uPAmRNA表达的影响。应用Millicell小室分析VEGF165转染前后胃癌细胞迁移能力的变化；逆转录聚合酶链反应(RTPCR)研究VEGF165转染前后BGC823的MMP2、uPAmRNA表达变化。结果：迁移实验结果显示AdVEGF165组胃

2、癌细胞迁移能力高于AdGFP组及对照组［(212.0000±10.1488)vs(142.6667±14.5028)and(148.3333±7.5718),P<0.05］;RTPCR结果显示VEGF165转染后促进了BGC823的MMP2、uPAmRNA表达，AdVEGF165组MMP2、uPA的mRNA水平明显高于AdGFP组及对照组［MMP2mRNA：（0.6646±0.0486）vs（0.4096±0.0668）and（0.3803±0.0254）；uPAmRNA：（0.8216±0.0798）vs（0.4060±0

3、.1158）and（0.4043±0.0620）;均为P<0.05］。结论：经VEGF165转染后，胃癌细胞迁移能力增强，MMP2、uPA的mRNA表达增加，提示VEGF在肿瘤的侵袭过程中发挥促进作用，MMP2、uPA可能与此作用有关。【关键词】血管内皮生长因子165;胃癌;侵袭；迁移实验；基质金属蛋白酶2;尿激酶型纤溶酶原激活物胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，淋巴结转移、血行转移和腹膜种植转移是其最常见的转移方式,预后较差。阐明胃癌细胞侵袭转移的机制,可以为胃癌侵袭转移的早期诊断和靶向治疗提供理论基础。近年来人们已经在人和动物的胃

4、癌组织中发现血管内皮生长因子(vascularendothelialgroatrixmetalloproteinases2，MMP2)、尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinasetypeplasminogenactivator，uPA)分泌的影响，旨在进一步探讨VEGF在胃癌侵袭转移中的作用及可能机制，对胃癌转移和复发的早期诊断及靶向治疗有重要意义。1材料和方法1.1材料人胃腺癌细胞株BGC823购自中国科学院，复制缺陷型腺病毒(Ad)重组体AdVEGF165及对照病毒Ad绿色荧光蛋白(GFP)由南京医科大学第一附属医院构建并赠送，RPM

5、I1640低糖培养基购自美国Gibcobrl公司，胎牛血清购自杭州四季青公司。Trizol试剂及RTPCR试剂盒购自日本TaKaRa公司，PCR引物由上海英俊生物技术有限公司设计并合成。1.2方法1.2.1细胞培养BGC823用含有10%胎牛血清的RPMI1640培养液于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养，以0.25%胰蛋白酶消化后进行传代，一般1～2d传1代，1瓶接种2至3瓶，隔日更换培养液继续培养。1.2.2病毒转染实验分成对照组、AdGFP组和AdVEGF165组等3组，以细胞浓度为2.0×105ml-1分别取3ml接种于3个培养瓶

6、(50ml)中，于60%～70%细胞贴壁时吸出原培养液，对照组加入无血清无抗生素RPMI1640培养液3ml，后两组加入相应的无血清无抗生素RPMI1640培养液稀释的病毒液3ml转染［在前期试验中已经测得Ad的感染复数(MOI)值在20的时候达到最佳的感染效果，本实验MOI值与前期实验相同］。8h后换含10%胎牛血清的RPMI1640培养液继续培养36h，对转染前后的细胞行部分生物学特性研究。1.2.3Millicell小室细胞体外迁移实验分别收集对照组、AdGFP组和AdVEGF165组细胞，用0.25%胰酶消化后,使用无胎牛血清的RPMI16

7、40培养液洗涤细胞3次，制成单细胞悬液，细胞浓度为1×105ml-1。将Millicell小室放入6孔板中，下室中加入1600μl含10%胎牛血清的培养液,上室加入无胎牛血清RPMI1640培养液稀释的单细胞悬液100μl,每组细胞设3个复孔,置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养8h，取出滤膜,用95%酒精固定细胞，然后行HE染色，轻轻用棉签擦净小室上室面无侵袭性的细胞，显微镜下每张滤膜随机取5个视野,计数穿膜细胞数,取平均数表示每组肿瘤细胞的迁移能力。1.2.4RTPCR检测VEGF165转染前后BGC823的MMP2、uPAmRNA表达

8、变化分组仍为对照组、AdGFP组和AdVEGF165组，按前述方法培养及感染细胞后进行逆转