转化生长因子β1对牛血管内皮细胞ⅳ型胶原基因表达的影响

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1、转化生长因子β1对牛血管内皮细胞Ⅳ型胶原基因表达的影响转化生长因子β1对牛血管内皮细胞Ⅳ型胶原基因表达的影响2010-09-06张嘉　黄庆玲　张家庆　　我们以往的实验证实糖化终末产物(AGEs)可使共同培养的牛脑微血管内皮细胞(BCMEC)、牛脑微血管平滑肌细胞(BCMSMC)Ⅳ型胶原基因表达增加(结果另文发表)。为进一步探讨其机制，我们在共同培养体系中加入抗转化生长因子β1(TGF-β1)抗血清，以了解TGF-β1是否参与了这一过程。一、材料与方法　　1.材料：(1)火鸡抗人TGF-β1抗血清

2、：NIH-NCILaboratoryofChemoprevention,NamRoche博士惠赠。已证实可中和牛TGF-β1。(2)鼠Ⅳ型胶原cDNA探针：0.8Kb。(3)DIG，DNA标记及检测药盒：德国BoehringerMannheim产品。　　2.方法：(1)AGEs的体外孵育：参照Vlassara等〔1〕的方法略作修改。(2)细胞体外分离、培养及鉴定：参照孙笃新等的方法〔2〕。经电镜及Ⅷ因子相关抗原免疫荧光鉴定，证明149μm尼龙网上收集的微血管长出的为平滑肌细胞，电镜下可见平滑肌细

3、胞特有的肌丝，Ⅷ因子相关抗原免疫荧光染色阴性〔3〕。而74μm尼龙网上收集的微血管长出的为内皮细胞，电镜下所见符合内皮细胞形态特征，Ⅷ因子相关抗原免疫荧光染色呈亮黄色〔2〕。当细胞长成致密单层后可传代培养，第3～5代细胞用于实验研究。(3)细胞总RNA抽提及杂交：按1：4混合接触培养的BCMEC、BCMSMC分为4组，每组重复4份，对照组以含5.5mmol/LD-葡萄糖的10%FCS-DMEM/1640培养48小时，AGEs组加AGEs(1mg/ml)，另外两组在加入AGEs之前分别以火鸡抗人T

4、GF-β1抗血清(1：1000)及正常对照血清(1：1000)37℃孵育1小时。培养结束后清洗并收集细胞，参照一步法常规抽提细胞总RNA。RNA样品变性后，每个样品取40μg作梯度倍比稀释，用96孔点样器点于尼龙膜上，80℃烘烤2小时、预杂交2小时，再与DIG标记的Ⅳ型胶原cDNA探针(0.8Kb)杂交，以三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)探针作内参照，用DIG标记及检测药盒进行显色16小时。(4)mRNA半定量检测：杂交膜用密度扫描仪测定光吸收值，结果以Ⅳ型胶原/GAPDH的光吸收值比值表示。　

5、　3.统计学分析：采用F检验及Q检验进行各组间统计学分析。二、结果　　4组间mRNA　表达有显著统计学差　异。AGEs　培养　48　小时使　Ⅳ型胶原mRNA表达显著提高，预先用抗TGF-β1抗血清孵育组mRNA水平受到明显抑制，而正常对照血清则无此作用(表1)。表1　抗TGF-β1抗血清对共培养细胞Ⅳ型胶原基因表达的影响(±s)组别例数Ⅳ型胶原mRNA正常对照组40.95±0.06AGEs组41.48±0.11*AGEs+抗TGF-β1抗血清组41.10±0.09#AGEs+正常41.42±0.

6、16△*　　注：与对照组比较，*P＜0.01；与AGEs组比较，#P＜0.01；与AGEs+抗血清组比较，△P＜0.05三、讨论　　我们以往的实验已经证明，在BCMEC、BCMSMC共同培养上清中有活性TGF-β1产生，TGF-β1与细胞外基质形成密切相关，它既可通过调节细胞外基质基因表达来促进基质的合成，又可通过抑制蛋白酶的合成及增加蛋白酶原激活抑制物(PAI-1)来减少细胞外基质的分解，因而使细胞外基质在细胞外堆积，细胞基底膜增厚。　　AGEs可促进共同培养细胞Ⅳ型胶原的基因表达(结果另文发

7、表)，为探讨AGEs这一作用的机制，我们在AGEs作用的BCMEC、BCMSMC共同培养体系中加入抗TGF-β1抗血清，发现它至少部分抑制了内皮细胞Ⅳ型胶原mRNA的表达，而正常对照血清则无此作用，提示TGF-β1至少部分参与了AGEs对内皮细胞Ⅳ外基质基因表达的调节。　　内皮细胞上存在TGF-β1受体〔4〕，活性TGF-β1可通过自分泌或旁分泌的方式影响内皮细胞的功能〔5〕，而在AGEs作用下活性TGF-β1的增加亦可能以自分泌或旁分泌的方式参与了对内皮细胞Ⅳ型胶原mRNA表达的调节。除TGF

8、-β1外，其他细胞因子也可能参与这一过程。AGEs与细胞受体结合，可促进细胞产生白细胞介素-2、肿瘤坏死因子-α、内皮素-1等多种细胞因子，它们都有促进细胞外基质合成的作用。　　BCMEC、BCMSMC共同培养模型模拟了内皮细胞在体内的生长环境，通过这一模型的体外实验研究，至少说明在体内亦可能有类似的作用机制发生，提示体内长期高　血　糖　形　成的　AGEs，可能通过TGF-β1的参与而使微血管内皮细胞外基质合成增加，最终导致血管基底膜增厚，促进了糖尿病慢性微血管病变的发生。作者单位：200433