血管新生中内皮细胞表型的基因表达谱分析

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1、血管新生中内皮细胞表型的基因表达谱分析Geneexpressionprofilingofendothelialcellphenotypesduringangiogenesis作者姓名：路曼专业名称：病理学与病理生理学指导教师：李莉莎副教授学位类别：医学硕士答辩日期：2015年5月21日摘要血管新生中内皮细胞表型的基因表达谱分析背景:血管分布广泛，为机体提供氧气和营养，运走代谢废物；病理情况下，也可以促进肿瘤的发生发展。目前研究最为广泛的肿瘤血管形成途径为血管新生（Angiogenesis）。在此过程中，内皮细胞（endothelialcell,EC）形成三种表

2、型：1.迁移表型，称顶端细胞（tipcell）；2.增殖表型，称柄细胞（stalkcell）；3.静息表型，称方阵细胞（phalanxcell）。这三种表型EC对于血管新生的发生发展至关重要。方法：采用高密度接种和血清饥饿法制备人脐静脉内皮细胞（humanumbilicalveinendothelialcell，HUVEC）系的静息表型，低密度接种和血清培养法制备HUVEC系增殖表型，Boyden小室法制备HUVEC系迁移表型；应用EdU法和流式细胞术检测HUVEC系的增殖能力，苏木精染色法检测HUVEC系的迁移能力，胰酶消化法收集迁移表型HUVEC系；利用基

3、因芯片分析法在全基因组范围内筛选不同表型差异基因，并通过实时定量PCR(quantitativereversetranscriptionpolymerasechainreaction,qRT–PCR)验证。结果：1.体外获取HUVEC系静息表型，应用EdU法检测阳性率约5%，流式细胞术检测HUVEC系细胞周期，处于G1期细胞多于90%，S期低于10%，与EdU法检测结果基本一致。2.体外获取HUVEC系增殖表型，应用EdU法检测阳性率近80%，流式细胞术检测90%HUVEC系处于S期，与EdU法检测结果相似。3.Boyden小室提供趋化浓度梯度，制备HUVEC

4、系迁移表型。苏木精染色观察到HUVEC系迁移进入下室；对迁移细胞采用胰酶消化法收集，获取HUVEC系迁移表型，随着迁移时间的延长，收获细胞数量逐渐增加；EdU法检测阳性率约15%，流式细胞术检测S期比例也约为15%。4.基因芯片分析增殖表型中差异表达基因。根据基因的生物过程分类，与静息表型EC相比，上调基因主要参与细胞周期，细胞核分裂和有丝分裂等生物过程；下调基因主要参与转录调控，RNA代谢和信号通路调节等生物过程；另外，差异基因主要参与DNA复制，细胞周期和嘧啶的代谢等信号通路。I5.基因芯片分析FBS诱导的迁移表型中差异表达基因。根据基因的生物过程分类，与

5、静息表型EC相比，上调基因主要参与细胞死亡，磷酸盐代谢和血管新生等生物过程；下调基因主要参与转录调节，RNA代谢和GTP酶活性的调节等生物过程。6.基因芯片分析VEGF诱导的迁移表型中差异表达基因。根据基因的生物过程分类，与静息表型EC相比，上调基因主要参与固醇的生物合成和代谢，脂质合成等生物过程；下调基因主要参与转录调控和胚胎发育的前后胚轴图式形成等生物过程；另外，差异基因主要参与固醇和萜类化合物的生物合成等信号通路。7.对HUVEC系三种表型中10个差异表达基因进行qRT-PCR验证，结果与芯片结果相近。结论：1.采用不同接种密度和培养条件的体外制备方式成

6、功获取HUVEC系的静息、增殖、迁移表型。2.基因芯片筛选出三种表型的差异基因，生物信息学分析证实体外获取方法可行，并为进一步探究不同表型中的调节机制提供了数据资源。3.不同诱导因子获取的迁移表型差异基因为研究单因素和多因素的迁移诱导方式提供了潜在的研究方向。关键词:血管新生，内皮细胞，表型，基因表达IIAbstractGeneexpressionprofilingofendothelialcellphenotypesduringangiogenesisBackground:Bloodvesselsarewidelydistributed,provideoxy

7、genandnutrientsforbody,andtakeawaymetabolicwaste;theyalsopromotetumordevelopmentinpathologicalconditions.Angiogenesisisthemostwidelyinvestigatedmodesoftumorbloodvesselsformationatpresent.Duringangiogenesis,therearethreephenotypesofEC:1.migratingphenotype,knownastipcell;2.proliferati

8、ngphenotype,calleds