基因表达谱分析技术_3190

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1、基因表达谱分析技术1微阵列技术(microarray)这是近年来发展起来的可用于人规模快速检测基因差别表达、基因纟fl表达谱、DNA序列多态性、致病基因或疾病相关基因的一项新的基因功能研究技术。其原理基本是利用光导化学合成、照相平板卬刷以及固相表面化学合成等技术，在固相表面合成成千上万个寡核昔酸“探针”(cDNA.ESTs或基因特界的寡核背酸)，并与放射性同位素或荧光物标记的來自不同细胞、组织或整个器官的DNA或mRXA反转录牛成的笫一链cDNA进行杂交，然后用特殊的检测系统对每个杂交点进行定量分析。其优点是可以同时对人虽基因，共至整个基因纟fl的基因表达进行对比分析。包括cDNA芯片(cD

2、NAmicroarray)和DNA芯片(DNAchips)。cDNA芯片使用的载体可以是尼龙膜，也nJ以是玻片。当便用尼龙膜吋，目前的技术水平可以将20000份材料点在一张12cmX18cm的膜上。尼龙膜上所点的一般是编好顺序的变性了的双链cDNA片段。要得到基因表达情况的数据，只需要将未知的样品与其杂交即可。杂交的结果表示这一样詁中基因的表达模式，而比较两份不同样站的朵交结果就可以得到在不同样品中表达模式存在差异的基因。杂交使用的探针一般为mRNA的反转录产物，标记探针使用32PdATP。如果使用玻片为载体，点阵的密度要高于尼龙膜。杂交时使用两种不同颜色的荧光标记不同的两份样品，然后将两份

3、样品混合起來与一张芯片杂交。洗去未杂交的探针以后，能够结合标记cDNA的点受到激发后会发出荧光。通过扫描装置对以检测各个点发出荧光的强度。对每一个点而言，所发出的两种不同荧光的强度的比值，就代表它在不同样品屮的丰度。一般来讲，显示出来的图像中，黄色的点表示在不同的样品中丰度的差异不大，红色和绿色的点代表在不同样品中其丰度各不相同。便用尼龙膜为载体制作cDNA芯片进行研究的费用要比玻片低，因为尼龙膜可以重复杂交。检测两种不同的组织或和同组织在不同条件卞基因表达的差界，只需要使用少量的尼龙膜。但是利用玻片制作的cDNA芯片灵敏度更高，

4、仏几可以使用2种探创•同时与芯片杂交，从而降低了因为杂交操作

5、带来的差异；缺点是无法重复使用还必须使用更为复杂的仪器。Guo等(2004)将包含104个重组子的cDNA文库点在芯片上，用丁•检测拟南芥叶片衰老时的基因表达模式，得到大约6200差异表达的ESTs,对应2491个非重复基因。其中冇134个基因编码转录因子，182个基因预测参与信号传导，如MAPK级联传导路径。Li等(2006)设计髙密度的寡核甘酸tilingmicroarray方法，检测釉稻全基因组转录表达况。芯片上包含13,07&888个36-mer寡核昔酸探针,基于釉稻全基因组shot-gun测序的序列合成，大约81.9%(35,970)的基因发生转录事件。Hu等(2006)用含有60

6、,000寡核昔酸探针(代表水稻全部预测表达基因)的芯片检测抗旱转基因植株(过量表达SNAC1水稻)中基因的表达情况，揭示人量的逆境相关基因都是上升表达的。2基因表达系列分析(Serialanalysisofgeneexpression,SAGE)基因表达系列分析(SAGE)是一种转录物水平上研究细胞或组织基因表达模式的快速、冇效的技术，也是一•种高通最的功能基因组研究方法，它可以同时将不同基因的表达情况进行最化研究(Velculescuetal.,1995)。SAGE的基本原理是：每一条mRA序列都可以用它包含的9bp的小片段(TAG)代替，因此考查这些TAGs出现的频率就能知道每一种mR

7、NA的丰度。首先利用生物素标记的oligo(dT)引物将mRNA反转录成双链cDNA,然后利用Nlalll酶切双链cDNA。Nlalll酶的识别位点只有4bp,因此cDNA都被切成儿十bp的小片段。带有生物素标记的小片段cDNA被分离出来，平均分成2份。这2份cDNA分别跟2个接头连接，2个接头中均有一个FokT酶切位点。FokT是一种ITS型核酸内切酶，其识别位点不对称，切割位点位于识别位点下游9bp且不依赖于特异的DNA序列。l；okl酶切分成2份的cDNA之后，带冇部分接头序列的TAGS就被释放下来。这时将2份cDNA混合起来，进行连接反应。根据接头序列设计引物扩增连接反应的产物，然后

8、通过NlaTTT酶切PCR产物得到连接在一起的两个TAG,即ditago将ditags串连起來，克隆到质粒载体中。一般每个克隆包含50个左右的ditagso这些克隆经过PCR扩增然后测序。因为每一个ditagZ间都是以Nlalll识别位点间隔的，所以很容易对每个的ditag进行区分和计数。而每一个TAG在SAGE库中出现的频率就代表了该基因的表达水平。利用SAGE可以在短期内得到丰富的衣达信息，与直接测定cD