全基因组表达谱分析方法(dge)

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1、全基因组表达谱分析方法（DGE）----基于新一代测序技术的技术路线该方法首先从每个mRNA的3’端酶切得到一段21bp的TAG片段（特异性标记该基因）；然后通过高通量测序，得到大量的TAG序列，不同的TAG序列的数量就代表了相应基因的表达量；通过生物信息学分析得到TAG代表的基因、基因表达水平、以及样品间基因表达差异等信息。技术路线如下：1、样品准备：a)提供浓度≥300ng/ul、总量≥6ug、OD260/280为1.8~2.2的总RNA样品；2、样品制备（见图1-1）：a)类似SAGE技术，通过特异性酶切的方法从每个mRNA的3’末端得到一段21bp的特异

2、性片段，用来标记该基因，称为TAG；b)在TAG片段两端连接上用于测序的接头引物；3、上机测序：a)通过高通量测序每个样品可以得到至少250万条TAG序列；4、基本信息分析：a)对原始数据进行基本处理，得到高质量的TAG序列；b)通过统计每个TAG序列的数量，得到该TAG标记的基因的表达量；c)对TAG进行注释，建立TAG和基因的对应关系；d)基因在正义链和反义链上表达量间的关系；e)其它统计分析；5、高级信息分析：a)基因在样品间差异表达分析；b)库容量饱和度分析；c)其它分析；测序优势利用高通量测序进行表达谱研究的优势很明显，具体如下：1．数字化信号：直接测

3、定每个基因的特异性表达标签序列，通过计数表达标签序列的数目来确定该基因的表达量，大大提高了定量分析的准确度。整体表达差异分布符合正态分布，不会因为不同批次实验引起不必要的误差。2．可重复性高：不同批次的表达谱度量准确，能够更准确的进行表达差异分析。3．高灵敏度：对于表达差异不大的基因能够灵敏的检测其表达差异；能够检测出低丰度的表达基因。4．全基因组分析，高性价比：由于该技术不用事先设计探针，而是直接测序的方式，因此无需了解物种基因信息，可以直接对任何物种进行包括未知基因在内的全基因组表达谱分析，因此性价比很高。5．高通量测序：已有数据表明，当测序通量达到200万

4、个表达标签时，即可得到样本中接近全部表达基因的表达量数据，而目前每个样本分析可以得到300万~600万个表达标签。6．无需重复实验。7．可同时发现新的转录本、基因组表达调控区域等。8．完整深入的生物信息学分析支持，更有助于进行重要的科学发现，发高质量的文章。表达谱案例分析肺癌组织的表达谱分析：选取2个肺癌病人（5T和10T）的组织提取总RNA，进行分析。实验目的：为了检测两个病人中表达差异较大的基因，以便找出两个病人症状差异的原因，并进行下一步相关的研究。1、数据质量的概述通过严格的质量标准筛选后，通过率达到80%，最终得到500万左右的Tag标签。2、标签的初

5、步分析统计两个样品中有95%的Tag重复频度超过1，73%以上的Tag重复频度超过50。3、表达谱测序饱和度分析通过对表达谱测序饱和度的分析，通常在表达谱Tag数目达到200万时，测序Tag接近饱和。因此，通过Solexa测序，仅需要1次试验，就可以得到足够后续进行表达分析的数据。4、样品重复性。5、Tag标签的注释（含cDNA，预测基因，EST，线粒体基因组，基因组等）本案例中，人的2万7千个基因中有50~60%都被Tag所覆盖。即一般的基因的表达量差异被检测出来。为了提高Tag同基因关联的可信度，我们仅仅选取了在基因序列中唯一定位的Tag。这部分唯一定位的T

6、ag占全部Tag数目的50%左右。另外，除去上述用于基因表达量统计的唯一定位Tag，有大约20%的Tag被定位到了基因组的未注释区域，其中大约有10万个Tag在基因组上的位置是唯一的。利用这些数据我们找到了许多新的转录本和调控区域。同时发现了若干潜在的两个样品间显著差异的区域。为后续的实验提供了可靠的研究目标。6、参考Tag标签的统计分析下表显示的人的参考Tag的统计信息，我们可以看到96.53%的基因都拥有Tag。说明Tag-based新一代测序技术的方法进行表达谱分析的可行性7、基因表达量的分布统计8、样本间表达差异基因的相关分析通过对表达差异基因的统计和分

7、析，我们可以选取样品间表达存在差异的基因，反馈给用户；此外一些已经报道可能相关的基因，是这一部分研究的重点，通过表达差异，我们可以推测出相关基因可能发生的变化。针对此例，图3-3中2个基因是已经报道的在10T样品中高表达的基因。9、样本间表达差异基因的信号通路相关分析对差异表达基因进行功能分析和信号通路分析。结合样本性状差异，鉴定与性状关联的候选基因，以便通过进一步实验验证。10、根据Tag距离3’端的位置对tag和基因数目进行的统计分析