老龄肾阳虚证的差异表达基因谱分析

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1、老龄肾阳虚证的差异表达基因谱分析作者：李炜弘雍小嘉范怀昌谭从娥张天娥王米渠【摘要】目的采用基因表达谱芯片技术，分析老龄肾阳虚证的发生与基因表达异常间的联系。方法筛选肾阳虚证患者3名和正常对照者3名，采用美国Affymetrix公司的HG-u133Plus2.0基因表达谱芯片，通过组间比较，筛选出老龄肾阳虚患者差异表达基因。结果芯片数据组间比较分析后获得34条差异表达基因，聚类分析得到6条有特征性地差异表达基因，主要涉及细胞周期和凋亡，肿瘤发生以及免疫。结论老龄肾阳虚证的发生涉及一系列免疫紊乱的复杂的过程，可能与个体的衰老存在密切关联。【关键词】肾阳虚证差异表达基因免疫衰老Abstra

2、ct：ObjectiveToexploretherelevancebeteandthedifferentiallyexpressedgenesbycDNAarrary.MethodsThreekidney-Yangdeficiencypatientsandthreehealthypeopleplesduringtheepidemiologicsurveyofthekidney-Yangdeficiencysyndrome.ThedifferentiallyexpressedgenesetrixGeneChip.Results34mondifferentiallyexpressedge

3、nesorigenesisandimmunityeisrelatedtothedysfunctionoftheimmunesystem,maybeclosedrelatedtobodyagEingasmuneresponse;AgEIng随着人类基因组计划的深入，尤其是功能基因组学研究技术的不断发展，在基因表达谱芯片技术平台上［1］开展的“证候-基因表达谱”研究从一个新的视角，系统、全面地深化人们对中医证候的认识，把证候与分子网络的功能联系起来。在以往对肾阳虚的研究中，已进行肾阳虚半定量化操作标准［2］以及虚寒证、心阳虚证等基因芯片实验研究［3］提示，肾阳虚证一定具有特定的分子生物学

4、基础；肾阳虚的辨证论治其理其法在基因水平、分子水平有深层次的科学依据。研究中还发现年龄是“证”的基因表达不可忽略的影响因素，而肾阳虚证在老龄人群中占有较大比例。结合多年“证候－基因组”研究的经验，笔者选用国际公认的美国Affymetrix公司的人全基因组表达谱芯片，开展了特定老龄人群肾阳虚证的差异基因表达谱的分析研究，探讨老龄肾阳虚证所涉及的分子生物学过程，为进一步揭示肾阳虚证的本质奠定基础。1研究对象在60岁以上老龄人群肾阳虚证的流行病学调查过程中筛选了3例肾阳虚证患者，年龄在60～70岁之间，体检无西医诊断的器质性疾病，经中医专家诊断和肾阳虚证量表［2］评分相结合，符合典型肾阳虚

5、证诊断。另外，选取同年龄段、性别一致的3例健康老人为正常对照，此3例对照者经体检，均无西医诊断的器质性疾病，无身体不适症状，并经过中医专家诊断和肾阳虚证量表评分，均无肾阳虚临床表征。2方法2.1提取总RNA分别采取肾阳虚证患者与正常人的空腹静脉血10ml，裂解红细胞，分离获得白细胞，采用Trizol法提取总RNA，并对总RNA进行定量、质检。2.2基因芯片检测利用单轮cRNA扩增、生物素标记法对样品进行靶标制备，然后用于芯片杂交；芯片采用美国Affymetrix公司的HG-u133Plus2.0基因表达谱芯片，每例样品检测1张，共6张。用FluidicsStation450进行洗脱和

6、染色，然后用Scanner3000扫描芯片；用GeneChipOperatingsoftetrix公司寡核苷酸芯片检测结果已得到国际权威学术界的公认。采用成组T检验的方法分析结果，用foldchange大于1.5或者小于0.6667，pvalue小于0.05，得到肾阳虚证组与健康对照组间的差异表达基因34个，其中表达水平下调的有28条基因，表达水平上调的仅有6条基因。见表2。3.2.2肾阳虚证差异表达基因的聚类分析采用Cluster3.0对上述34条基因进行聚类分析，如图1所示。肾阳虚证组和健康对照组间有6条基因有明显的组间辨识特征。见表3。表16例样本肾阳虚证各症状因子及其定量评分

7、结果（略）sh1，sh2，sh3为3例典型肾阳虚证患者，肾阳虚证半定量诊断总分值分别为36，29，36;h1，h2，h3为3例健康对照者，肾阳虚证半定量诊断总分值分别为3，2，5表2肾阳虚证差异表达基因（略）表3肾阳虚证特征差异表达基因（略）图1肾阳虚证差异表达基因聚类图（略）4讨论4.1实验的质量控制既往对肾阳虚证病机、诊断、治疗、生理、生化、神经-内分泌-免疫调控等研究，提示该证很可能涉及一大群差异表达基因，拥有复杂而独特的分子生物学内涵［4］。基因芯