探讨不同来源的细胞因子诱导的杀伤细胞体外抗肿瘤作用的比较研究

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1、探讨不同来源的细胞因子诱导的杀伤细胞体外抗肿瘤作用的比较研究细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokineinducedkillercells，CIK)是一群异质性的具有抗肿瘤作用的细胞。CIK细胞主要表达CD3和CD56，抗肿瘤活性强，增殖迅速。用患者自身PBMC诱导的CIK细胞已经显示良好的临床疗效，尤其对慢性髓系白血病、肝癌、结直肠癌、肾癌、肺癌、乳腺癌等。但是肿瘤患者在经历了放化疗后，经常出现白细胞减少、贫血等症状。尤其晚期恶性肿瘤患者每毫升外周血中单核细胞的数量也较正常人少。因此为了减轻患者负担，提高临床疗效，

2、本研究比较了来自健康捐助者的脐血CIK细胞和来自肺癌患者外周血的CIK细胞在体外的抗肿瘤作用，并初步探讨了其机制上的差异，以寻找更有效可行的CIK治疗方法。　　1材料与方法　　1.1材料　　白血病细胞系K562和肺癌细胞系A549由吉林省肿瘤防治研究所常规传代培养。Rebinanthumaninterleukin(IL)-2、IFN-γ、CD3-mAb(OKT-3)、IL-1α购自Biolegend。PI、anti-CD3-ECD、anti-CD56-PC5、anti-CD8-PC5、ant

3、iCD3-FITC、anti-CD8-FITC及相应的同型对照抗体均购自贝克曼库尔特公司。5，6-carboxyfluoresceindiacetatesuccinimidyester(CFSE)购自MolecularProbes。AnnexinVapoptosiskit购自BD公司。MonensinSolution(BioLegend，Cat.420701)。PEanti-humanCD107a(Lysosome-AssociatedMembraneProtein1，LAMP-1，BioLegend，Cat.32

4、8608，Clone:H4A3)。CCK-8购自碧云天生物技术公司。　　1.2方法　　1.2.1诱导培养CIK细胞肺癌患者外周血(4份，　　10mL/份)来自吉林省肿瘤医院住院患者(2014年8月～2015年8月);4份脐血(10mL/份)来自吉林省妇幼保健院(2014年8月～2015年8月)。血液样本分别经红细胞裂解液处理后，获得的细胞被培养在IMDM培养基中(10%FCS，37℃，5%CO2饱和湿度)，细胞浓度(1～2)106/mL。培养24h后，加入1000U/mLIFN-γ，CD3-mAb(50

5、ng/mL)，IL-2(300U/mL)，IL-1α(100U/mL)，继续培养并每3天半量换液或扩瓶1次，同时补加IL-2(300U/mL)。在培养的第14天和第21天收获细胞，流式细胞仪检测分析(BeckmanCoulterEpicsXL-MCL)细胞表型，即CD3+CD56+、CD3+CD8+细胞百分率。　　1.2.2CIK细胞增殖实验采用CCK-8染色法检测诱导培养21d的脐血CIK细胞和来自肺癌患者外周血的CIK细胞的增殖率。调整CIK细胞的初始密度为5104/mL，37℃、5%CO2培养箱中

6、培养，每3天扩瓶1次，CCK-8染色，酶标仪检测(490nm)，直到第21天，计算增殖率并分析比较实验结果。　　1.2.3CIK细胞体外抗肿瘤活性实验(流式细胞仪法)　　标记靶细胞：A549和K562细胞用PBS洗1遍，调整细胞浓度为1.5106/mL，CFSE(2.5μmol/L)标记细胞，37℃孵育8min，PBS洗细胞1次，加入1mLIMDM(含10%FCS)，室温避光孵育10min，再加入PBS洗细胞1次备用。标记效应细胞：调整CIK细胞浓度为1106/100μL，标记用CD3、CD8和CD56

7、抗体，室温避光孵育30min，细胞用PBS洗1次备用。调整靶细胞密度为5104/mL，设置不同的效靶比，分别为1∶1、5∶1、10∶1，相应的CIK效应细胞浓度分别为5104/mL、25104/mL、50104/mL，分别设单独的靶细胞和效应细胞对照，37℃、5%CO2培养箱中培养24h后，PI染色，流式细胞仪检测分析。　　1.2.4CIK细胞体外抗肿瘤活性实验(MTT法)按上述同样的效靶比将细胞接种于96孔板中，靶细胞浓度为2104/孔，37℃5%CO2培养箱中培养24h后，加入CIK细胞，MTT法检测CIK对靶

8、细胞的杀伤效率。酶标仪检测490nm处吸光度(A)值。抑制率(%)=[1-(实验组A值-CIK细胞A值)/肿瘤细胞A值]100%。　　1.3观察指标　　1.3.1检测CIK细胞CD107a表达调整CIK细胞浓　　度为1106/100μL，加入CD107a-PE(10μL)，37℃，5%CO2培养箱中培养1h后，加入Monensin，将效应细胞和靶