树突状细胞的体外培养及其诱导的抗肿瘤免疫作用

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1、树突状细胞的体外培养及其诱导的抗肿瘤免疫作用张建芳，于文彬，徐修礼，苏明权，马越云，刘家云，丁振若【关键词】树突状细胞　　关键词:树突状细胞;LAK细胞;免疫治疗　　摘要:目的建立体外培养扩增树突状细胞（DC）的方法，并观察其诱导的抗肿瘤免疫作用.方法分离外周血单个核细胞，应用GM-CSF及IL-4诱导DC产生，用TNF-α和PGE2促进其成熟，并用肺癌细胞系GLC-82可溶性抗原致敏.将成熟DC与自体LAK细胞混合培养（DC-LAK），用MTT法检测DC-LAK细胞及LAK细胞对多种肿瘤细胞系的杀伤作用.结果经GM-CSF，IL-4，TNF-α，PGE2作用后，细胞表达CD1a阳

2、性率为71.0%，CD8350.0%，CD14阳性率低于10.0%，高表达HLA-Ⅰ，HLA-Ⅱ和CD45，为典型的DC表型特征.DC-LAK和LAK细胞对4种肿瘤细胞（GLC-82，A549，moser和MCF-7）的杀伤率，前者为84.7%，66.9%，49.3%和56.0%，后者为43.5%，31.3%，45.0%和32.4%.结论成功的诱导出具有典型形态特征及增强LAK细胞杀伤活性的DC.　　Invitrogenerationofhumanblooddendriticcellsforactivetumorimmunotherapy　　Abstract:AIMToestabl

3、ishamethodtoculturedendriticcells（DC）invitroandtoobservetheanti-tumoreffectin-ducedbyDC.METHODSDendriticcellsPBMCstimulatedorsolubleantigenabstractedfromlungcan-cercelllineGLC-82.TNF-αandPGE2ixedcellsedDC-LAK.CytotoxicityofDC-LAKandLAKeasuredbyMTTassay.RESULTSTheculturedDCexpressedHLA-Ⅰ，HLA-Ⅱa

4、ndCD45andpositiveratesofCD1a，CD83andCD14oserandMCF-7）PBMCsuc-cessfully.　　0引言　　近年来树突状细胞（DC）可有效地递呈可溶性肿瘤抗原，增强机体对肿瘤的特异性免疫应答，并在临床取得了成绩〔1，2〕.我们将外周血中贴壁的单个核细胞作为DC的前体细胞，联合应用一组细胞因子诱导获得了纯度较高的人树突状细胞，并将之与LAK细胞结合，体外诱导产生了相对高效而特异的抗肿瘤免疫作用.　　1材料和方法　　1.1材料　　基因重组人IL-4，TNF-α和GM-CSF为Promega公司产品，PGE2购自Sigma公司，淋巴细胞分离

5、液购自上海医学试剂厂，IL-2为本校基因研究所产品，抗CD1a-FITC和抗CD83-FITC购自晶美公司，HLA-Ⅰ，HLA-Ⅱ抗体及羊抗鼠-FITC购自北京邦定公司，酶联免疫检测仪为Labsystem产品;CD14/CD45双色荧光标记抗体由西京医院免疫科提供.肺癌A549为本校基础部免疫学教研室提供;乳腺癌MCF-7细胞引自军事医学科学院;大肠癌moser细胞、肺癌GLC-82细胞为本室保留株.各细胞系均用含50mL・L-1小牛血清的RPMI1640培养液，于37℃，50mL・L-1CO2条件下常规培养.　　1.2方法　　1.2.1肿瘤可溶性抗原提取　　收集肿瘤细胞于低渗条件

6、下反复冻融4次，以5000r・min-1离心30min，取上清，用考马斯亮蓝染料结合法测定蛋白质含量，过滤后冻存备用.　　1.2.2DC及LAK细胞的制备　　以常规方法分离PBMC，然后用含100mL・L-1FCS的RPMI1640培养液悬浮，以每孔5×106个细胞加入6孔板，于37℃，50mL・L-1CO2条件下贴壁2h，用预热的培养液轻轻洗出非贴壁细胞，调密度至1×109・L-1，加IL-2300kU・L-1，37℃，50mL・L-1CO2条件下培养，每4d换液1次，为LAK细胞.贴壁细胞加完全1640培养液，用100μg・L-1的GM-CSF及1000U・L-1的IL-4联合

7、刺激诱导DC分化.DC培养4d，加入GLC-82细胞可溶性抗原100μg・L-1，6d加TNF-α（1000kU・L-1），PGE2（10μmol・L-1）.10d将DC与LAK细胞混合培养4h，称为DC-LAK.　　1.2.3细胞表型分析　　收集培养7d的细胞，直接（抗CD14/抗CD45，抗CD1a和抗CD83mAb）或间接（抗HLA-I，抗HLA-ⅡmAb）免疫荧光染色后，用流式细胞仪分析.　　1.2.4体外细胞毒活性测定　　以LAK，DC-LAK为效应细胞，以